Подготовка и иммунофлуоресцентное окрашивание пучков и клеток отдельных волокон коры и ядра хрусталика глаза
Summary
В этом протоколе описаны методы подготовки периферических, зрелых и ядерных клеток волокон хрусталика глаза к иммунофлуоресцентному окрашиванию для изучения сложных межклеточных взаимосвязей и мембранной архитектуры.
Abstract
Хрусталик представляет собой прозрачный эллипсоидный орган в передней камере глаза, который меняет форму, чтобы точно сфокусировать свет на сетчатке и сформировать четкое изображение. Основная часть этой ткани состоит из специализированных дифференцированных волоконных клеток, которые имеют шестиугольное поперечное сечение и простираются от переднего до заднего полюсов хрусталика. Эти длинные и тонкие клетки плотно противостоят соседним клеткам и имеют сложные межпальцевые соединения по длине клетки. Специализированные взаимосвязанные структуры необходимы для нормальных биомеханических свойств хрусталика и были подробно описаны с помощью методов электронной микроскопии. Этот протокол демонстрирует первый метод сохранения и иммуноокрашивания сингулярных клеток, а также пучков волокон хрусталика мыши, что позволяет детально локализовать белки в этих клетках сложной формы. Репрезентативные данные показывают окрашивание периферических, дифференцирующих, зрелых и ядерных волоконных клеток во всех областях хрусталика. Этот метод потенциально может быть использован на волоконных клетках, выделенных из линз других видов.
Introduction
Хрусталик представляет собой прозрачную яйцевидную ткань в передней камере глаза, состоящую из двух типов клеток: эпителиальных и волоконныхклеток1 (рис. 1). Существует монослой эпителиальных клеток, который покрывает переднее полушарие хрусталика. Волоконные клетки дифференцируются от эпителиальных клеток и составляют основную часть хрусталика. Высокоспециализированные волоконные клетки подвергаются программированию удлинения, дифференцировки и созревания, отмеченному отчетливыми изменениями морфологии клеточной мембраны от периферии хрусталика к центру хрусталика 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , также известный как ядро хрусталика. Функция хрусталика точно фокусировать свет, поступающий с различных расстояний на сетчатку, зависит от его биомеханических свойств, включая жесткость и эластичность 13,14,15,16,17,18,19. Были выдвинуты гипотезы о сложных взаимосвязях волокон хрусталика 20,21 и недавно показано, что они важны для жесткости хрусталика 22,23.
Рисунок 1: Диаграммы анатомии хрусталика и репрезентативные изображения волокон хрусталика методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). На рисунке показан продольный (от переднего к заднему сверху вниз) вид переднего монослоя эпителиальных клеток (заштрихован светло-голубым цветом) и объемной массы клеток хрусталика (белый). Центр хрусталика (заштрихован розовым цветом) известен как ядро и состоит из сильно уплотненных волоконных клеток. Справа на поперечном срезе изображена вытянутая шестиугольная форма ячеек волокон хрусталика, упакованных в сотовый рисунок. Ячейки волокна имеют две широкие стороны и четыре короткие. Репрезентативные СЭМ-изображения вдоль дна показывают сложные мембранные взаимосвязи между клетками волокон хрусталика на разной глубине хрусталика. Справа новообразованные волокна хрусталика на периферии хрусталика имеют небольшие выступы по коротким сторонам и шарико-гнездовые гнезда по широкой стороне (красные прямоугольники). Во время созревания волокна хрусталика развивают крупные лопастные домены, которые украшены небольшими выступами по коротким сторонам (синими прямоугольниками). Зрелые волокнистые клетки обладают большими лопастичными доменами, проиллюстрированными небольшими выступами. Эти взаимосвязанные домены важны для биомеханических свойств линз. Волокнистые клетки в ядре хрусталика имеют меньше мелких выступов вдоль своих коротких сторон и имеют сложные шпунтовые интердигитации (фиолетовые коробочки). На широких сторонах клетки наблюдается морфология шаровой мембраны. Мультфильм был изменен с22,32 и не нарисован в масштабе. Масштабная линейка = 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Хрусталик растет за счет добавления оболочек из новых волоконных ячеек, наложенных поверх волокон предыдущих поколений24,25. Ячейки волокна имеют вытянутую, шестиугольную форму поперечного сечения с двумя широкими сторонами и четырьмя короткими сторонами. Эти клетки простираются от переднего до заднего полюса хрусталика, и в зависимости от вида, волокна хрусталика могут быть несколько миллиметров в длину. Чтобы поддерживать структуру этих удлиненных и тонких клеток, специализированные взаимосвязи вдоль широкой и короткой сторон создают взаимосвязанные структуры для поддержания формы хрусталика и биомеханических свойств. Изменения формы клеточной мембраны во время дифференцировки и созревания волоконных клеток были подробно задокументированы исследованиями электронной микроскопии (ЭМ) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Новообразованные волокнистые клетки имеют шарики и гнезда вдоль своих широких сторон с очень маленькими выступами вдоль коротких сторон, в то время как зрелые волокна имеют взаимосвязанные выступы и лопасти вдоль коротких сторон. Ядерные волокна демонстрируют шпунтовые интердигитации и морфологию глобулярной мембраны. Мало что известно о белках, которые необходимы для этих сложных взаимосвязанных мембран. Предыдущие исследования локализации белков в волоконных клетках основывались на срезах ткани хрусталика, которые не позволяют четко визуализировать сложную клеточную архитектуру.
Эта работа создала и усовершенствовала новый метод фиксации отдельных и пучков клеток волокон хрусталика для сохранения сложной морфологии и обеспечения иммуноокрашивания белков на клеточной мембране и в цитоплазме. Этот метод достоверно сохраняет архитектуру клеточной мембраны, сопоставимую с данными ЭМ-исследований, и позволяет окрашивать первичными антителами к конкретным белкам. Ранее у нас были иммуноокрашенные кортикальные волокна хрусталика, подвергающиеся дифференцировке и созреванию22,23. В этом протоколе также есть новый метод окрашивания клеток волокна из ядра хрусталика. Этот протокол открывает дверь к пониманию механизмов формирования и изменений мембранных интердигитов во время созревания клеток волокна и уплотнения ядра хрусталика.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол продемонстрировал методы фиксации, консервации и иммуноокрашивания, которые точно сохраняют морфологию 3D-мембраны пучков или отдельных клеток волокон хрусталика с различной глубины в хрусталике. Окрашенные волокна хрусталика сравниваются с препаратами SEM, которые уже ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом R01 EY032056 (CC) от Национального института глаза. Авторы благодарят д-ра Терезу Фассель и Кимберли Вандерпул из Исследовательского центра керновой микроскопии Скриппса за помощь в получении изображений с помощью электронного микроскопа.
Materials
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al. Morphology of the normal human lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. Stiffness gradient in the crystalline lens. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R. The development of lens sutures. Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E., Saunders, W. B. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
