Summary
В этом протоколе описаны методы подготовки периферических, зрелых и ядерных клеток волокон хрусталика глаза к иммунофлуоресцентному окрашиванию для изучения сложных межклеточных взаимосвязей и мембранной архитектуры.
Abstract
Хрусталик представляет собой прозрачный эллипсоидный орган в передней камере глаза, который меняет форму, чтобы точно сфокусировать свет на сетчатке и сформировать четкое изображение. Основная часть этой ткани состоит из специализированных дифференцированных волоконных клеток, которые имеют шестиугольное поперечное сечение и простираются от переднего до заднего полюсов хрусталика. Эти длинные и тонкие клетки плотно противостоят соседним клеткам и имеют сложные межпальцевые соединения по длине клетки. Специализированные взаимосвязанные структуры необходимы для нормальных биомеханических свойств хрусталика и были подробно описаны с помощью методов электронной микроскопии. Этот протокол демонстрирует первый метод сохранения и иммуноокрашивания сингулярных клеток, а также пучков волокон хрусталика мыши, что позволяет детально локализовать белки в этих клетках сложной формы. Репрезентативные данные показывают окрашивание периферических, дифференцирующих, зрелых и ядерных волоконных клеток во всех областях хрусталика. Этот метод потенциально может быть использован на волоконных клетках, выделенных из линз других видов.
Introduction
Хрусталик представляет собой прозрачную яйцевидную ткань в передней камере глаза, состоящую из двух типов клеток: эпителиальных и волоконныхклеток1 (рис. 1). Существует монослой эпителиальных клеток, который покрывает переднее полушарие хрусталика. Волоконные клетки дифференцируются от эпителиальных клеток и составляют основную часть хрусталика. Высокоспециализированные волоконные клетки подвергаются программированию удлинения, дифференцировки и созревания, отмеченному отчетливыми изменениями морфологии клеточной мембраны от периферии хрусталика к центру хрусталика 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , также известный как ядро хрусталика. Функция хрусталика точно фокусировать свет, поступающий с различных расстояний на сетчатку, зависит от его биомеханических свойств, включая жесткость и эластичность 13,14,15,16,17,18,19. Были выдвинуты гипотезы о сложных взаимосвязях волокон хрусталика 20,21 и недавно показано, что они важны для жесткости хрусталика 22,23.
Рисунок 1: Диаграммы анатомии хрусталика и репрезентативные изображения волокон хрусталика методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). На рисунке показан продольный (от переднего к заднему сверху вниз) вид переднего монослоя эпителиальных клеток (заштрихован светло-голубым цветом) и объемной массы клеток хрусталика (белый). Центр хрусталика (заштрихован розовым цветом) известен как ядро и состоит из сильно уплотненных волоконных клеток. Справа на поперечном срезе изображена вытянутая шестиугольная форма ячеек волокон хрусталика, упакованных в сотовый рисунок. Ячейки волокна имеют две широкие стороны и четыре короткие. Репрезентативные СЭМ-изображения вдоль дна показывают сложные мембранные взаимосвязи между клетками волокон хрусталика на разной глубине хрусталика. Справа новообразованные волокна хрусталика на периферии хрусталика имеют небольшие выступы по коротким сторонам и шарико-гнездовые гнезда по широкой стороне (красные прямоугольники). Во время созревания волокна хрусталика развивают крупные лопастные домены, которые украшены небольшими выступами по коротким сторонам (синими прямоугольниками). Зрелые волокнистые клетки обладают большими лопастичными доменами, проиллюстрированными небольшими выступами. Эти взаимосвязанные домены важны для биомеханических свойств линз. Волокнистые клетки в ядре хрусталика имеют меньше мелких выступов вдоль своих коротких сторон и имеют сложные шпунтовые интердигитации (фиолетовые коробочки). На широких сторонах клетки наблюдается морфология шаровой мембраны. Мультфильм был изменен с22,32 и не нарисован в масштабе. Масштабная линейка = 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Хрусталик растет за счет добавления оболочек из новых волоконных ячеек, наложенных поверх волокон предыдущих поколений24,25. Ячейки волокна имеют вытянутую, шестиугольную форму поперечного сечения с двумя широкими сторонами и четырьмя короткими сторонами. Эти клетки простираются от переднего до заднего полюса хрусталика, и в зависимости от вида, волокна хрусталика могут быть несколько миллиметров в длину. Чтобы поддерживать структуру этих удлиненных и тонких клеток, специализированные взаимосвязи вдоль широкой и короткой сторон создают взаимосвязанные структуры для поддержания формы хрусталика и биомеханических свойств. Изменения формы клеточной мембраны во время дифференцировки и созревания волоконных клеток были подробно задокументированы исследованиями электронной микроскопии (ЭМ) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Новообразованные волокнистые клетки имеют шарики и гнезда вдоль своих широких сторон с очень маленькими выступами вдоль коротких сторон, в то время как зрелые волокна имеют взаимосвязанные выступы и лопасти вдоль коротких сторон. Ядерные волокна демонстрируют шпунтовые интердигитации и морфологию глобулярной мембраны. Мало что известно о белках, которые необходимы для этих сложных взаимосвязанных мембран. Предыдущие исследования локализации белков в волоконных клетках основывались на срезах ткани хрусталика, которые не позволяют четко визуализировать сложную клеточную архитектуру.
Эта работа создала и усовершенствовала новый метод фиксации отдельных и пучков клеток волокон хрусталика для сохранения сложной морфологии и обеспечения иммуноокрашивания белков на клеточной мембране и в цитоплазме. Этот метод достоверно сохраняет архитектуру клеточной мембраны, сопоставимую с данными ЭМ-исследований, и позволяет окрашивать первичными антителами к конкретным белкам. Ранее у нас были иммуноокрашенные кортикальные волокна хрусталика, подвергающиеся дифференцировке и созреванию22,23. В этом протоколе также есть новый метод окрашивания клеток волокна из ядра хрусталика. Этот протокол открывает дверь к пониманию механизмов формирования и изменений мембранных интердигитов во время созревания клеток волокна и уплотнения ядра хрусталика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за мышами осуществлялся на основе протокола, одобренного Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Индианы в Блумингтоне. Мыши, использованные для получения репрезентативных данных, были контрольными (дикими) животными на фоне C57BL6/J, самками и в возрасте 8-12 недель. Для этого эксперимента можно использовать как самцов, так и самок мышей, так как пол мышей вряд ли повлияет на результат эксперимента.
1. Вскрытие и декапсулирование хрусталика
- Усыпляйте мышей в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального института здравоохранения, а также протоколами использования животных, утвержденными учреждением.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании мышей усыпляли от передозировкиСО2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с утвержденным протоколом для животных (Университет Индианы). - Энуклейте глаза мышей с помощью изогнутых щипцов, вдавливая ткани вокруг глаз одной стороной щипцов, чтобы вытеснить глаз из глазницы. Затем закройте щипцы под глазом и поднимите, чтобы извлечь глаз из глазницы. Переложите глаза в свежий 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) в лоток для вскрытия.
- Перережьте зрительный нерв ультратонкими ножницами как можно ближе к глазному яблоку. Осторожно введите тонкий прямой пинцет в глазное яблоко через выход зрительного нерва в задней части глаза.
- Осторожно вставьте ножницы в то же место, что и пинцет на шаге 1.3, и начните делать разрез сзади по направлению к роговично-склеральному соединению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы грызунов занимают ~30% их глаз. Случайное повреждение произойдет, если пинцет или ножницы будут введены слишком глубоко в глаз. - Продолжайте разрезать вдоль роговично-склерального соединения до тех пор, пока не будет отделена хотя бы половина соединения.
- С помощью пинцета осторожно надавите на роговицу, чтобы хрусталик мог выйти через разрез, выполненный шагами 1,4 и 1,5.
- Осторожно удалите крупные кусочки ткани с линзы с помощью прямого пинцета с тонким наконечником. Осмотрите линзу, чтобы найти экваториальную область.
- Неглубоко проткните линзу с помощью прямого пинцета с тонким наконечником, а затем снимите капсулу объектива. Масса клеток волокон хрусталика останется нетронутой, а эпителиальный монослой хрусталика останется прикрепленным к капсуле хрусталика. Выбросьте капсулу хрусталика.
2. Окрашивание одноволоконных ячеек линзы
- Перенесите клеточную массу волокна хрусталика в лунку с 500 мкл свежеприготовленного 1% раствора параформальдегида (PFA; в 1x PBS) и инкубируйте образцы при 4 °C в течение ночи с осторожной нутацией (рис. 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы для приведенных растворов оптимизированы для 48-луночных планшетов. Если используются скважинные пластины или трубки другого размера, отрегулируйте объемы растворов соответствующим образом. Растворы фиксации, блокировки и промывки (1x PTX, 0,1% Triton X-100 в 1x PBS) изготавливали с 10x PBS и двойной дистиллированной водой (ddH2O) до конечной концентрации 1x PBS. - Перенесите ячейки волокон хрусталика в чашку диаметром 60 мм с 1% PFA. Острым скальпелем разделите шарик из клеток волокна пополам вдоль его передне-задней оси (рис. 2Б). Разрежьте половинки еще раз пополам по той же оси, чтобы получились четвертинки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Передне-задняя ось легко распознается по направлению волоконных клеток в тканевой массе. - С помощью прямого пинцета удалите область ядра из четвертей клетки волокна хрусталика (рис. 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Область ядра хрусталика у грызунов жесткая, и центр хрусталика легко отделяется от более мягких кортикальных волокон. - После фиксации четверти области коры хрусталика в 200 мкл 1% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) с легким встряхиванием (300 об/мин на шейкере).
- Промойте четвертинки ткани дважды в 750 мкл 1x PBS в течение 5 минут каждый с легким встряхиванием при RT.
- Блокируют образцы с помощью 200 мкл блокирующего раствора (5% сыворотка, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) в течение 1 ч при RT с легким встряхиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных данных в этом протоколе образцы не были окрашены первичными или вторичными антителами. После этапа блокировки образцы инкубировали с агглютинином зародышей пшеницы (WGA; 1:100) и фаллоидином (1:100) (см. таблицу материалов) в течение 3 ч при RT с легким встряхиванием и защитой от света. Первичное окрашивание антителами было продемонстрировано в предыдущих публикациях22,23. - Инкубируют со 100 мкл раствора первичных антител в течение ночи при температуре 4 °C при легком встряхивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела разводят в блокирующем растворе. По сравнению с предметными стеклами с тканевыми срезами, в этом типе препаратов больше клеток. Концентрация первичных антител должна быть увеличена, чтобы обеспечить достаточное количество антител для окрашивания большего количества клеток. Рекомендуется удвоить концентрацию антител по сравнению с тем, что используется на срезах тканей. То же самое относится и к вторичным антителам. - Вымойте четвертинки ткани три раза с помощью 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) в течение 5 минут каждая при RT с легким встряхиванием.
- Инкубируют клетки волокна со 100 мкл раствора вторичного антитела/красителя в течение 3 ч при ЛТ при легком встряхивании. Защищайте образцы от света на этом и последующих этапах.
ПРИМЕЧАНИЕ: WGA, фаллоидин и другие флуоресцентные красители могут быть добавлены во вторичный раствор антител для одновременного мечения клеточной мембраны, цитоскелета или других органелл, а также мечения первичного антитела. - Промойте ячейки волокна четыре раза с помощью 1x PTX в течение 5 минут каждый при RT с легким встряхиванием.
- Добавьте одну каплю или 50 мкл монтажной среды на предметное стекло микроскопа с плюс-зарядкой перед переносом четвертинок ткани на предметное стекло.
- Используйте пинцет, чтобы аккуратно отделить ячейки волокон друг от друга и постараться ограничить перекрытие пучков клеток.
- Аккуратно нанесите покровный слой #1.5 поверх образца в монтажной среде. Монтажный материал должен распространяться до края покровного стекла; Если этого не происходит, добавьте дополнительный монтажный материал к краю защитного стекла. Удалите излишки монтажного материала по краю покровного стекла и используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края покровного стекла на предметном стекле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов можно использовать любой тип монтажной среды, разработанной для конфокальной микроскопии.
3. Окрашивание ядра хрусталика одним волокном
- Завершите препарирование, описанное в разделе 1.
- Механически удаляют кортикальные волокна из шарика клеток хрусталика, покидая ядро хрусталика, аккуратно перенося клеточную массу волокна на влажные кончики пальцев в перчатках и осторожно перекатывая тканевую массу.
ПРИМЕЧАНИЕ: В мышиных линзах перекатывание шарика из клеток волокон хрусталика между кончиками пальцев в перчатках является эффективным методом удаления клеток кортикальных волокон из ядра твердого хрусталика28,30. Для линз, где этот механический метод неэффективен, для удаления клеток кортикальных волокон может быть использовано тщательное препарирование или вихревой метод29. - Переложите ядро хрусталика в свежеприготовленный 1% раствор PFA в лунке и инкубируйте в течение ночи при 4 °C при легком встряхивании.
- Перенесите образец в чашку диаметром 60 мм с 1% PFA и острым скальпелем расщепите ядро хрусталика вдоль передне-задней оси. Снова разрежьте образцы тканей пополам, чтобы получить четвертинки ядра.
- Следуйте процедуре, описанной в шагах 2.4-2.13 для иммуноокрашивания и монтирования образца.
Рисунок 2: Графическая сводка с подробным описанием подготовки и иммуноокрашивания клеток волокон хрусталика . (A) Эта 48-луночная пластина имеет цветовую маркировку по столбцам, чтобы продемонстрировать настройку планшета для образцов для описанных методов, что позволяет легко перемещать образцы между различными этапами иммуноокрашивания путем бережного обращения с помощью щипцов. Несмотря на то, что репрезентативные данные для этого протокола не инкубируются с первичными антителами, диаграмма включает столбец для инкубации первичных антител, а лунки для промывки могут быть повторно использованы после удаления использованных промывочных буферов путем аспирации. (B) После фиксации клеточной массы волокон хрусталика ткань расщепляется вдоль передне-задней оси (красные пунктирные линии) для сохранения первоначальной структуры клеток. После того, как тканевая масса была уменьшена вдвое, образцы поворачивают, и половинки разделяют на четверти вдоль передне-задней оси (красные пунктирные линии). (C) Удаление области ядра хрусталика (розовый цвет) легко выполняется с помощью пинцета, чтобы выкопать плотную центральную ткань из клеток кортикальных волокон (синим цветом). Мультяшные диаграммы были частично созданы с использованием BioRender.com, а не нарисованы в масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки волокон хрусталика получают из коры хрусталика (дифференцирующие волокна и зрелые волокна) и ядра, и клетки окрашивают фаллоидином для F-актина и WGA для клеточной мембраны. Наблюдается и визуализируется смесь пучков клеток или отдельных волокон хрусталика (рис. 3). В коре хрусталика обнаруживаются два типа клеток (рис. 3А). Дифференцирующиеся волоконные клетки на периферии хрусталика прямые, с очень маленькими выступами по коротким сторонам. По мере дифференцировки клетки волокна становятся волнистыми с небольшими взаимосвязанными выступами. Далее, в процессе созревания, в клетках волокна развиваются крупные лопасти, украшенные небольшими взаимосвязанными выступами. Ядро хрусталика очень компактное и жесткое в хрусталиках мышей и изолировано путем механического удаления более мягкой коры хрусталика перед фиксацией и окрашиванием волокон ядерного хрусталика. Из ядра хрусталика обнаруживаются пучки волокон хрусталика, которые меньше по диаметру и имеют тонкую мембранную структуру, которую нелегко увидеть на изображении с малым увеличением.
При 3D-реконструкции волоконных клеток хрусталика из разных областей хрусталика с большим увеличением (рис. 3B) обнаружено, что F-актин и WGA сильно локализованы на клеточной мембране в дифференцирующихся и зрелых волоконных клетках. F-актин обогащается в смыкающихся выступах вдоль клеточной мембраны в дифференцирующихся и зрелых волокнах (рис. 3Б, стрелки). Зрелые волокнистые клетки развивают большие взаимосвязанные лопасти (рис. 3Б, звездочки). Окрашивание WGA не полностью локализовано с сигналом F-актина, особенно в зрелой волоконной клетке, что позволяет предположить, что кортикальная актиновая сеть не поддерживает все более мелкие структуры вдоль клеточной мембраны. Неожиданно обнаруживается, что сеть F-актина находится в цитоплазме клеток ядерных волокон. В то время как сигнал F-актина распространяется в выступы (рис. 3B, стрелки) вдоль клеточной мембраны ядерного волокна, актиновая сеть больше не обогащается вблизи клеточной мембраны или внутри выступов. В морфологии клетки ядерного волокна отсутствуют лопасти, а также уменьшается организация и частота выпячиваний.
Рисунок 3: Конфокальные изображения пучков (с малым увеличением) и одиночные (с большим увеличением) изображения волоконных ячеек из разных областей хрусталика. Клетки окрашивают WGA (клеточные мембраны, зеленый), фаллоидин (F-актин, красный) и DAPI (ядра, синий). (А) В этих препаратах часто обнаруживаются пучки клеток волокон хрусталика из разных областей. В корковых препаратах находятся дифференцирующиеся и зрелые волокнистые клетки. Эти различные клетки имеют различную морфологию, что позволяет легко идентифицировать их. В образцах из ядра хрусталика обнаружены клеточные пучки волокон, а также диссоциированные волокна. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) Z-стеки через отдельные дифференцированные, зрелые и ядерные ячейки волокна собираются, и для реконструкции показанных изображений используется 3D-рендеринг. Дифференцирующиеся и зрелые волокна имеют множество мелких выступов по коротким сторонам (стрелками отмечены избранные). Эти небольшие выпячивания обогащены F-актином. Зрелое волокно также имеет большие взаимосвязанные лопастные домены (звездочки). Ядерные волокна имеют небольшие мембранные карманы и углубления, окрашенные WGA, и сохраняют несколько выступов вдоль своих коротких сторон (стрелок). Удивительно, но сеть F-актина теперь распределена в цитоплазме клетки без обогащенных сигналов на клеточной мембране. Сеть F-актина распространяется на небольшие выпячивания. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
При исследовании волоконных клеток важно обратить внимание на ориентацию клеток, чтобы избежать путаницы в отношении того, какой тип клеток наблюдается. Z-стеки собираются через ячейки, а затем используется 3D-реконструкция для просмотра ортогональных 2D-проекций в плоскостях XY, XZ и YZ. Из-за случайной ориентации клеток в этом препарате можно получить клетки, которые не лежат идеально ровно на предметном стекле (рис. 4). Все клетки на этом репрезентативном изображении являются зрелыми волокнами хрусталика, но каждая клетка имеет совершенно разный внешний вид в плоскости XY. Клетка, псевдоокрашенная в зеленый цвет, ориентирована широкой стороной вверх с видимыми лопастями и выступами, в то время как клетка, псевдоокрашенная в розовый цвет, лежит короткой стороной вверх. Это легче визуализировать в плоскости XZ, показывая перпендикулярную ориентацию двух ячеек, показанных в плоскости XY. При исследовании плоскости YZ отчетливо видны лопасти зрелого волокна, окрашенного в розовый цвет с плоскости XY.
Рисунок 4: Ортогональные 2D-проекции (плоскости XY, XZ и YZ) 3D конфокальных z-стеков через группу отдельных зрелых клеток волокон хрусталика, окрашенных фаллоидином для F-актина. Две ячейки псевдоокрашены в розовый или зеленый цвет для идентификации на каждой плоскости. В плоскости XY розовая клетка лежит короткой стороной вверх, в то время как зеленая клетка лежит плашмя широкой стороной вверх. В плоскости XZ видно, что розовая ячейка наклонена по ориентации, в то время как зеленая ячейка параллельна предметному стеклу. В плоскости YZ наблюдаются лопасти и выступы розовых клеток, подтверждающие, что эта клетка является зрелой волокнистой клеткой. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Поскольку волокна имеют толщину около2-4 мкм 25,31, можно через набор z-стеков просматривать поверхность клетки или плоскость через цитоплазму (рис. 5). Это лучше всего работает на клетках, которые почти параллельны покровному стекле, с широкой стороной ячейки, обращенной вверх. Клеточную поверхность в этой зрелой волоконной ячейке можно оценить, наблюдая за сигналом WGA (рис. 5A). Плоскость XZ ясно показывает, что эта плоскость XY находится вдоль широкой стороны ячейки. Небольшие точки WGA+ вдоль мембраны предполагают шероховатую морфологию клеточной поверхности. Небольшие выступы вдоль короткой стороны на изображениях с низкой экспозицией показывают значительно обогащенный сигнал F-актина. При более высокой экспозиции, когда сигнал F-актина в выступах насыщен, через клеточную мембрану наблюдается тонкая сетчатая сеть F-актина (звездочки). При рассмотрении плоскости XY через цитоплазму зрелого волокна (рис. 5Б) окрашивание WGA наблюдается в основном вдоль клеточной мембраны. Подобно тому, что видно на поверхности клетки, F-актин обогащен в выступах вдоль коротких сторон, с сетчатой цитоплазматической F-актиновой сетью, видимой при более высоком воздействии (звездочки). Наша предыдущая работа показала окрашивание мембранных белков в плоскостях XY через цитоплазму клетки22,23, но с помощью этого метода также можно локализовать белки вдоль широкой боковой поверхности клетки.
Рисунок 5: Ортогональные 2D-проекции (плоскости XY и XZ) 3D конфокальных z-стеков через одну зрелую волоконную клетку, окрашенную WGA (зеленый) и фаллоидин (F-актин, красный). (A) Проекции с поверхности клетки вдоль широкой стороны показывают WGA вдоль клеточной мембраны, а пункты WGA предполагают, что мембрана не полностью гладкая. F-актин обогащен в выступах по коротким сторонам, и на изображении окрашивания F-актином при высокой экспозиции видна сетчатая сеть вдоль клеточной мембраны (звездочки). (Б) Другая плоскость, проходящая через цитоплазму той же клетки, показывает WGA вдоль клеточной мембраны, обрамляя клетку. F-актин образует сетчатую сеть через цитоплазму (звездочки) и значительно обогащается в выступах вдоль клеточной мембраны. Масштабные линейки = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Далее сравниваются изображения волокон хрусталика, полученные в ходе экспериментов по сканированию ЭМ (СЭМ) и окрашиванию. Эксперименты с СЭМ выполняют, как описано выше,29, и изображения делают последовательно от центра образца к периферии. Во-первых, исследуются дифференцированные волокна хрусталика с небольшими выступами (рис. 6, стрелки) по их коротким сторонам и шариковидным гнездом (стреловидные наконечники) по широким сторонам. Как и на изображении РЭМ (рис. 6А), в пучке дифференцирующих волокон, ориентированных по их коротким сторонам, шаровидные взаимные соединения представляют собой большие выступы и бороздки, простирающиеся вдоль широкой стороны ячеек (рис. 6Б, стрелки). Гнездо обнаруживается (рис. 6C, стрелки) при рассмотрении ячейки в ортогональных 2D-проекциях XY и XZ в одиночных дифференцирующих волокнах линзы. Небольшие взаимосвязанные выступы вдоль коротких сторон также точно сохраняются в этих окрашенных клетках волокон хрусталика по сравнению с таковыми на изображении СЭМ (стрелки). Далее исследуется морфология зрелых волоконных клеток (рис. 7). На изображении РЭМ и окрашенной ячейке вдоль широкой стороны ячеек имеются небольшие углубления (рис. 7A, B, наконечники стрелок). По-видимому, это остатки шаровидных межпальцевых соединений, которые уменьшаются в процессе созревания. Крупные лопасти (звездочки), украшенные небольшими взаимосвязанными выступами (стрелками), сопоставимы между ячейками в СЭМ и окрашенным зрелым волокном. Ячейки на изображении РЭМ также имеют явные бороздки, в которых взаимосвязанное выступление стыкуется с клеточной мембраной (рис. 7C, стрелки). Эти бороздки также можно увидеть в этих окрашенных ячейках, и они заполняются сигналом WGA (рис. 7D, стрелки). Бороздки могут выглядеть как выступы, идущие внутрь к клеточной цитоплазме, вместо того, чтобы выступать наружу от клеточной мембраны, и часто в бороздках видно только окрашивание WGA, которые имеют очень слабый, если вообще имеют, сигнал окрашивания F-актина.
Рисунок 6: СЭМ и конфокальный микроскоп изображений дифференцирующихся волоконных клеток из коры хрусталика. Клетки волокон для конфокальной микроскопии окрашивают WGA (зеленый) и фаллоидин (F-актин, красный). (А) СЭМ пучка дифференцирующих волокон хрусталика показывает шарико-гнездовые интердигитации (стрелочные наконечники) вдоль широкой стороны клеток с небольшими взаимосвязанными выступами (стрелками) вдоль коротких сторон клеток. (B) Конфокальные изображения пучка дифференцирующих волокон, полученные с коротких сторон, показывают большие шаровидные вкрапления вдоль широких сторон клеток (стрелки). (C) Ортогональные 2D-проекции (плоскости XY и XZ), проходящие через одно дифференцирующее волокно линзы, показывают шаровидную взаимосвязь (стрелки) вдоль широкой стороны и небольшие взаимосвязанные выступы вдоль короткой стороны (стрелки). Масштабные линейки = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: СЭМ и конфокальный микроскоп изображений зрелых волоконных клеток из коры хрусталика. Клетки волокон для конфокальной микроскопии окрашивают WGA (зеленый) и фаллоидин (F-актин, красный). (А) Изображение СЭМ имеет два взаимосвязанных зрелых волокна с лопастями (звездочками), украшенными небольшими выступами (стрелками) вдоль коротких сторон клеток. Также имеются небольшие углубления (наконечники стрел) вдоль широкой стороны ячейки. Возможно, это уменьшающиеся остатки шаровидных выступов. Масштабная линейка = 5 мкм. (B) Ортогональные 2D-проекции (плоскости XY и XZ) через одно зрелое волокно хрусталика имеют сцепленные большие лопасти (звездочки) и маленькие выступы (стрелки) вдоль коротких сторон ячеек. Вдоль широкой стороны ячейки видны небольшие кольца WGA+ (наконечники стрелок), похожие на углубления на изображении SEM. Эти структуры WGA+ не имеют F-актинового окрашивания. F-актин в основном обогащается на клеточной мембране в небольших выступах и имеет слабый сетчатый рисунок окрашивания в цитоплазме. Масштабная линейка = 5 мкм. (C) СЭМ-изображение зрелых волокон, показывающее множество бороздок в клеточной мембране (стрелки), где выступы из соседних клеток упираются и смыкаются. Масштабная линейка = 2 мкм. (D) Пара зрелых волокон, которые только что разделены, с бороздками (наконечниками стрел), окрашенными WGA. Бороздки не обогащены окрашиванием F-актином и выглядят как выступы, простирающиеся внутрь к цитозоль, а не наружу в виде смыкающейся структуры. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Наконец, окрашенные волокна ядерной линзы сравниваются с изображениями из препаратов SEM. Этот новый метод фиксации и окрашивания волокон ядерной хрусталика точно сохраняет морфологию волокон ядерной хрусталика в различных областях хрусталика (рис. 8). Ячейки ядерных волокон имеют нечастые и более крупные взаимосвязанные выступы вдоль своих коротких сторон (стрелки). Внешние волокна ядерной линзы имеют шероховатую текстуру клеточной мембраны, как видно как на СЭМ, так и на окрашенных клеточных изображениях. По мере того, как клетки подвергаются дальнейшему уплотнению по направлению к центру ядра, вдоль клеточной мембраны появляются шпунтовые взаимные соединения (звездочки), а самые внутренние ядерные волокна имеют морфологию глобулярной мембраны, которую можно оценить на СЭМ-изображении и при окрашивании WGA. F-актин уже не обогащается на клеточной мембране, а образует сеть, заполняющую цитоплазму и слабо распространяющуюся в выпячивания.
Рисунок 8: СЭМ и конфокальный микроскоп изображений волоконных ячеек хрусталика. Клетки волокон для конфокальной микроскопии окрашивают WGA (зеленый) и фаллоидин (F-актин, красный). (А) СЭМ-изображения ядерных волокон от внешних слоев по направлению к центру хрусталика показывают редкие и более крупные взаимосвязанные выступы на коротких сторонах ячеек (стрелки). Клеточная мембрана в этих клетках шероховатая, с язычковыми вкраплениями (звездочками) и морфологией глобулярной мембраны в самых внутренних клетках. (B) 3D-реконструкции конфокальных z-стеков с помощью волокон одиночных ядерных линз имеют характеристики, сопоставимые с изображениями СЭМ, включая выступы вдоль коротких сторон (стрелки), шпунтовые взаимные соединения (звездочки) и грубую морфологию мембраны, которая очевидна при окрашивании WGA. Ф-актин образует сеть, которая заполняет цитоплазму клетки и слабо распространяется в выпячивания. Масштабные линейки = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол продемонстрировал методы фиксации, консервации и иммуноокрашивания, которые точно сохраняют морфологию 3D-мембраны пучков или отдельных клеток волокон хрусталика с различной глубины в хрусталике. Окрашенные волокна хрусталика сравниваются с препаратами SEM, которые уже давно используются для изучения морфологии клеток волокон хрусталика. Результаты показывают сопоставимые мембранные структуры между обоими препаратами. ЭМ остается золотым стандартом для изучения морфологии клеток, но иммунометирование в образцах SEM для локализации белков33,34,35 является более сложной задачей и требует визуализации с помощью электронного микроскопа. Преимущество этого метода иммуноокрашивания заключается в том, что можно помечать сразу несколько мишеней, а изображения собираются на конфокальном микроскопе.
Несмотря на то, что метод сохраняет сложную морфологию клеток, СЭМ по-прежнему необходим для сравнения взаимосвязей между контрольными и измененными волокнами хрусталика из-за генетических мутаций, старения, фармацевтического лечения и т. д. Препарат иммуноокрашивания создает смесь клеток из коры хрусталика или ядра, которые случайным образом распределяются на предметном стекле. Таким образом, если морфология клеток изменена, может быть труднее определить глубину, на которой клетки располагались в хрусталике до диссоциации для окрашивания. В этих случаях может потребоваться дальнейшее рассечение хрусталика на интересующие области после фиксации и окрашивания меньших пучков волокон хрусталика для более высокой пространственной точности. Результаты окрашивания также следует сравнивать с СЭМ-изображениями, чтобы убедиться, что иммуноокрашенные волокна сохраняют морфологию измененных клеток.
Впервые было показано, что клетки ядерных волокон также могут быть сохранены для окрашивания с помощью этого нового метода. Важно удалить кору хрусталика перед фиксацией ядра, поскольку фиксирующее проникновение не достигает ядра хрусталика при фиксации всего хрусталика27. Метод этого протокола для выделения ядра хрусталика описывает механическое удаление более мягких кортикальных волокон хрусталика. Это возможно в линзах грызунов благодаря очень твердому и компактному ядру хрусталика 28,30,36. У других видов ядро хрусталика более мягкое, и могут потребоваться другие методы для изоляции этих клеток для окрашивания. Ранее для удаления клеток корковых волокон из нокаутной линии мышей с более мягким ядром хрусталика использовался метод вихря, который не мог быть надежно изолирован механическим удалением29.
Несмотря на то, что мы не продемонстрировали окрашивание первичными антителами в этих репрезентативных данных, мы ранее проводили тот же тип окрашивания первичными антителами и соответствующими вторичными антителами22,23. По нашему опыту, многие мембранные белки имеют точечный сигнал, и поэтому рекомендуется использовать WGA или F-актин в корковых волокнах или WGA в ядерных волокнах для четкого очерчивания клеточной мембраны, чтобы лучше локализовать белки клеточной мембраны и распознать каждую стадию клеточной дифференцировки и созревания. Окрашивание WGA или F-актином должно быть в видимом канале (красном, зеленом или синем), чтобы наблюдатель мог легко найти подходящие клетки для визуализации с помощью окуляра. Этот тип мембранного окрашивания также может помочь выявить любые повреждения клеток в процессе фиксации, окрашивания и монтажа, чтобы исключить механически поврежденные клетки. В этой и предыдущих работах22,23 механически поврежденные клетки наблюдаются редко.
Этот метод требует терпеливого и систематического обследования клеток для визуализации. Случайная смесь клеток может показаться довольно пугающей на первый взгляд, но клетки, лежащие в оптимальной ориентации, обычно можно найти. Этот метод может быть адаптирован для волокон хрусталика, выделенных из других видов. В больших линзах можно использовать тщательное препарирование для разделения различных слоев клеток перед иммуноокрашиванием. Таким образом, это исследование создало устойчивый и надежный метод сохранения пучков волокон или отдельных волоконных клеток для изучения их сложной морфологии и локализации белков в 3D в этих специализированных клетках. Этот уникальный протокол окрашивания ядерных волокон открывает новую область исследований менее изученных центральных волокон хрусталика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом R01 EY032056 (CC) от Национального института глаза. Авторы благодарят д-ра Терезу Фассель и Кимберли Вандерпул из Исследовательского центра керновой микроскопии Скриппса за помощь в получении изображений с помощью электронного микроскопа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
