Summary
该协议描述了制备用于免疫荧光染色的外周，成熟和核眼晶状体纤维细胞的方法，以研究复杂的细胞间指和膜结构。
Abstract
晶状体是眼睛前房中的透明椭圆形器官，它改变形状以将光线精细地聚焦到视网膜上以形成清晰的图像。这种组织的大部分由特化的分化纤维细胞组成，这些细胞具有六边形横截面，从晶状体的前极延伸到后极。这些又长又细的细胞与相邻的细胞紧密相对，并且沿细胞的长度具有复杂的指间。晶状体的正常生物力学特性需要特殊的互锁结构，并且已使用电子显微镜技术进行了广泛的描述。该协议展示了第一种方法来保存和免疫染色单一以及小鼠晶状体纤维细胞束，以允许在这些复杂形状的细胞内详细定位蛋白质。代表性数据显示晶状体所有区域的外周细胞、分化细胞、成熟细胞和核纤维细胞的染色。该方法可用于从其他物种的晶状体中分离的纤维细胞。
Introduction
晶状体是眼睛前房中的透明卵形组织，由两种细胞类型组成，即上皮细胞和纤维细胞1（图1）。有一层单层上皮细胞覆盖晶状体的前半球。纤维细胞从上皮细胞分化而来，构成晶状体的大部分。高度特化的纤维细胞经历伸长、分化和成熟编程，其特征是从晶状体外围到晶状体中心的细胞膜形态发生明显变化 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ，也称为晶状体核。晶状体对从不同距离射入视网膜的光线进行精细聚焦的功能取决于其生物力学特性，包括刚度和弹性 13、14、15、16、17、18、19。晶状体纤维的复杂交叉已被假设 20,21，最近被证明对晶状体刚度很重要 22,23。
图 1：晶状体纤维的晶状体解剖图和代表性扫描电子显微镜 （SEM） 图像。这幅漫画显示了上皮细胞前单层（浅蓝色阴影）和大量晶状体纤维细胞（白色）的纵向（从上到下从前到后）视图。晶状体的中心（粉红色阴影）被称为细胞核，由高度致密的纤维细胞组成。在右边，一幅横截面的卡通图显示了排列成蜂窝状的透镜纤维的细长六边形细胞形状。纤维细胞有两个宽边和四个短边。底部的代表性SEM图像显示了晶状体不同深度的晶状体纤维细胞之间的复杂膜状交叉。从右边看，晶状体周边新形成的透镜纤维沿短边有小突起，沿宽边有球窝（红框）。在成熟过程中，晶状体纤维会形成大的桨状结构域，这些桨状结构域由沿短边的小突起（蓝色框）装饰。成熟的纤维细胞具有大的桨状结构域，由小突起表示。这些互锁域对晶状体的生物力学特性很重要。晶状体核中的纤维细胞沿其短边具有较少的小突起，并具有复杂的榫槽状指（紫色框）。细胞的宽边显示球状膜形态。这幅漫画是从22,32 修改而来的，没有按比例绘制。比例尺 = 3 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
晶状体通过添加覆盖在前几代纤维24,25 上的新纤维细胞壳来生长。纤维细胞具有细长的六边形横截面形状，具有两个宽边和四个短边。这些细胞从晶状体的前极延伸到后极，根据物种的不同，晶状体纤维的长度可以达到几毫米。为了支持这些细长和瘦小细胞的结构，沿着宽边和短边的专门的指状结构创造了互锁结构，以保持晶状体形状和生物力学特性。电子显微镜 （EM） 研究广泛记录了纤维细胞分化和成熟过程中细胞膜形状的变化 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 .新形成的纤维细胞在其宽边上有球窝，短边有非常小的突起，而成熟纤维的短边有互锁的突起和桨。核纤维呈榫槽状交叉和球状膜形态。对于这些复杂的互锁膜所需的蛋白质知之甚少。以前关于纤维细胞中蛋白质定位的研究依赖于晶状体组织切片，这无法清晰地可视化复杂的细胞结构。
这项工作创造并完善了一种新方法，可以固定单个和成束的晶状体纤维细胞，以保持复杂的形态，并允许对细胞膜和细胞质内的蛋白质进行免疫染色。该方法忠实地保留了细胞膜结构，可与EM研究的数据相媲美，并允许使用特定蛋白质的一抗进行染色。我们之前对正在经历分化和成熟的皮质晶状体纤维进行了免疫染色22,23。在该协议中，还有一种从晶状体细胞核染色纤维细胞的新方法。该协议为了解纤维细胞成熟和晶状体细胞核压实过程中膜指的形成和变化机制打开了大门。
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Protocol
小鼠已根据印第安纳大学布卢明顿分校机构动物护理和使用委员会批准的动物协议进行护理。用于生成代表性数据的小鼠是 C57BL6/J 背景的对照（野生型）动物、雌性和 8-12 周龄。雄性和雌性小鼠都可用于该实验，因为小鼠的性别不太可能影响实验结果。
1.晶状体解剖和开封
- 按照美国国立卫生研究院的“实验动物护理和使用指南”以及该机构批准的动物使用协议对小鼠实施安乐死。
注：在本研究中，小鼠被 CO2 过量安乐死，然后根据批准的动物方案（印第安纳大学）进行宫颈脱位。 - 使用弯曲的镊子将眼睛从小鼠身上移开，方法是用镊子的一侧压住眼睛周围的组织，将眼睛移出眼窝。接下来，关闭眼睛下方的镊子并提起以将眼睛从眼窝中取出。将眼睛转移到解剖托盘中的新鲜1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
- 用超细剪刀尽可能靠近眼球剪断视神经。小心地将细尖直镊子通过眼后视神经出口插入眼球。
- 小心地将剪刀插入与步骤 1.3 中镊子相同的位置，然后开始从后部向角膜-巩膜交界处切开切口。
注意：啮齿动物的晶状体占据了眼睛的 ~30%。如果镊子或剪刀插入眼睛太深，就会发生意外损坏。 - 继续沿着角膜-巩膜交界处切割，直到至少一半的交界处分离。
- 使用镊子轻轻推动角膜，使晶状体可以通过步骤 1.4 和 1.5 的切口退出。
- 使用细尖直镊子小心地从镜片上去除任何大块组织。检查镜头以找到赤道区域。
- 使用细尖直镊子浅刺穿镜片，然后取出镜片囊。晶状体纤维细胞的质量将保持完整，晶状体上皮单层将保持附着在晶状体囊上。丢弃镜片胶囊。
2.晶状体单纤维细胞染色
- 将晶状体纤维细胞团转移到装有500μL新制备的1%多聚甲醛（PFA;在1x PBS溶液中）的孔板中，并将样品在4°C下孵育过夜，轻轻振动（图2A）。
注意：给定溶液的体积针对 48 孔板进行了优化。如果使用其他尺寸的孔板或试管，请相应地调整溶液的体积。用10x PBS和双蒸水（ddH2O）制成固定，封闭和洗涤（1x PTX，0.1%Triton X-100在1x PBS中）溶液至终浓度为1x PBS。 - 将晶状体纤维细胞转移到含有 1% PFA 的 60 mm 培养皿中。使用锋利的手术刀沿其前后轴将纤维细胞球分成两半（图2B）。沿同一轴再次将两半切成两半，以产生四分之一。
注意：前后轴很容易通过组织团块中纤维细胞的方向来识别。 - 使用直镊子从晶状体纤维细胞区去除细胞核区域（图2C）。
注意：啮齿动物晶状体的晶状体核区域是刚性的，晶状体的中心很容易与较软的皮质纤维分离。 - 在室温（RT）下轻轻摇动（在板振荡器上300rpm），将晶状体皮层区域的四分之一固定在200μL的1%PFA中15分钟。
- 在750μL的1x PBS中洗涤组织四分之一两次，每次5分钟，在室温下轻轻摇动。
- 使用200μL封闭溶液（5%血清，0.3%Triton X-100,1x PBS）在室温下轻轻摇动封闭样品1小时。
注：对于本协议中的代表性数据，样品未用一抗或二抗染色。封闭步骤后，将样品与小麦胚芽凝集素（WGA;1：100）和鬼笔环肽（1：100）（见材料表）在室温下孵育3小时，轻轻摇晃并避光。一抗染色已在先前的出版物中得到证实22,23。 - 用100μL一抗溶液在4°C下孵育过夜，轻轻摇动。
注：抗体在封闭液中稀释。与带有组织切片的载玻片相比，这种类型的制剂中有更多的细胞。应增加一抗浓度，以提供充足的抗体来染色更多细胞。建议将组织切片上使用的抗体浓度增加一倍。这同样适用于二抗。 - 在室温下用1x PTX（0.1%Triton X-100,1x PBS）洗涤组织区三次，每次5分钟，轻轻摇动。
- 将纤维细胞与 100 μL 二抗/染料溶液在室温下轻轻摇动孵育 3 小时。在此步骤和后续步骤中保护样品免受光照。
注：WGA、鬼笔环肽和其他荧光染料可以添加到二抗溶液中，用于同时标记细胞膜、细胞骨架或其他细胞器，同时标记一抗。 - 在室温下用1x PTX洗涤纤维细胞四次，每次5分钟，轻轻摇动。
- 在将组织区转移到载玻片上之前，将一滴或 50 μL 的封片介质添加到带正电荷的显微镜载玻片上。
- 使用镊子轻轻地将纤维细胞彼此分开，并尝试限制细胞束的重叠。
- 在封固剂中轻轻地将 #1.5 盖玻片涂在样品顶部。封固介质应扩散到盖玻片的边缘;如果没有发生这种情况，请在盖玻片的边缘添加一些额外的封固剂。吸走盖玻片边缘周围多余的封片介质，并使用指甲油将盖玻片的边缘密封在载玻片上。
注：为共聚焦显微镜配制的任何类型的封固剂都可用于这些实验。
3.晶状体核单纤维细胞染色
- 完成第 1 节中概述的剖析。
- 通过轻轻地将纤维细胞团转移到湿的戴手套的指尖并轻轻滚动组织团块，从晶状体纤维细胞球中机械地去除皮质纤维，离开晶状体核。
注：在小鼠晶状体中，在戴手套的指尖之间滚动晶状体纤维细胞球是从硬晶状体核中去除皮质纤维细胞的有效方法28,30。对于这种机械方法无效的晶状体，可以使用仔细解剖或涡旋方法29去除皮质纤维细胞。 - 将晶状体核转移到孔板中新鲜制备的1%PFA溶液中，并在4°C下轻轻摇动孵育过夜。
- 将样品转移到含有1%PFA的60mm培养皿中，并使用锋利的手术刀沿前后轴分裂晶状体核。再次将组织样本减半以产生细胞核四分之一。
- 按照步骤 2.4-2.13 中概述的过程进行免疫染色和样品封片。
图 2：详细介绍晶状体纤维细胞制备和 免疫染色的图形摘要。 （A） 该 48 孔板已按色谱柱进行颜色编码，以演示所述方法的样品板设置，通过使用镊子轻柔处理，允许在各种免疫染色步骤之间轻松转移样品。虽然该方案的代表性数据未与一抗一起孵育，但该图包括用于一抗孵育的柱，并且在通过抽吸除用过的洗涤缓冲液后，可以重复使用用于洗涤的孔。（B）固定晶状体纤维细胞团后，组织沿前后轴（红色虚线）分裂，以保留细胞的原始结构。一旦组织团块减半，将样品旋转，并将两半沿前后轴（红色虚线）分成四分之一。（C） 使用镊子从皮质纤维细胞（蓝色）中挖出致密的中央组织，很容易去除晶状体核区域（粉红色）。卡通图部分是使用 BioRender.com 创建的，而不是按比例绘制的。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
晶状体纤维细胞由晶状体皮层（分化纤维和成熟纤维）和细胞核制备，细胞用鬼笔环肽染色用于F-肌动蛋白，用WGA染色用于细胞膜。观察细胞束或单晶状体纤维的混合物（图3）并成像。从晶状体皮层中，发现了两种类型的细胞（图3A）。晶状体周边的分化纤维细胞是直的，沿其短边有非常小的突起。随着细胞的分化，纤维细胞变成波浪状，并带有小的互锁突起。此外，在成熟过程中，纤维细胞发展出装饰有小互锁突起的大桨叶。小鼠晶状体中的晶状体核高度致密和坚硬，在固定和染色核晶状体纤维之前 ，通过 机械去除较软的晶状体皮层进行隔离。从晶状体核中，发现直径较小的晶状体纤维束，并且具有在低倍率图像上不容易看到的精细膜结构。
在对来自晶状体不同区域的晶状体纤维细胞进行高倍率 3D 重建（图 3B）中，发现 F-肌动蛋白和 WGA 高度共定位在分化和成熟纤维细胞的细胞膜上。F-肌动蛋白富集在分化和成熟纤维中沿细胞膜的互锁突起中（图3B，箭头）。成熟的纤维细胞形成大的互锁桨叶（图3B，星号）。WGA染色与F-肌动蛋白信号不完全共定位，特别是在成熟纤维细胞中，这表明皮质肌动蛋白网络不支持沿细胞膜的所有较小结构。出乎意料的是，发现F-肌动蛋白网络位于核纤维细胞的细胞质内。当F-肌动蛋白信号沿着核纤维细胞膜延伸到突起（图3B，箭头）时，肌动蛋白网络不再富集在细胞膜附近或突起内。核纤维细胞的形态缺乏桨叶，此外还减少了突起的组织和频率。
图 3：来自晶状体不同区域的纤维细胞束（低放大倍率）和单个（高放大倍率）图像的共聚焦图像。 用WGA（细胞膜，绿色），鬼笔环肽（F-肌动蛋白，红色）和DAPI（细胞核，蓝色）对细胞进行染色。（A）在这些制剂中，经常发现来自不同区域的晶状体纤维细胞束。在皮质制剂中，有分化和成熟的纤维细胞。这些不同的细胞具有不同的形态，因此易于识别。在晶状体核的样品中，发现了纤维细胞束以及解离的纤维。比例尺 = 50 μm。 （B） 收集通过单个分化、成熟和核纤维细胞的 Z 层叠，并使用 3D 渲染来重建所示图像。分化的成熟纤维在其短边上有许多小突起（箭头标记选择的突起）。这些小突起富含 F-肌动蛋白。成熟的纤维还具有大的互锁桨叶域（星号）。核纤维具有小的膜袋和被 WGA 染色的凹陷，并在其短边（箭头）保留一些突起。令人惊讶的是，F-肌动蛋白网络现在分布在细胞质中，而细胞膜上没有富集信号。F-肌动蛋白网络确实延伸到小突起。比例尺 = 5 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
检查纤维细胞时，重要的是要注意细胞的方向，以避免混淆正在观察的细胞类型。通过单元收集 Z 堆栈，然后使用 3D 重建来查看 XY、XZ 和 YZ 平面中的正交 2D 投影。由于该制备中细胞的随机取向，因此可能具有不完全平放在载玻片上的细胞（图4）。这张代表性图像中的所有细胞都是成熟的晶状体纤维，但每个细胞在XY平面上的外观截然不同。绿色伪色的细胞是宽面朝上的，有可见的桨和突起，而粉红色的细胞伪色是短面朝上。这在 XZ 平面中更容易可视化，显示 XY 平面中显示的两个单元格的垂直方向。对 YZ 平面的检查清楚地显示了从 XY 平面呈粉红色的成熟纤维的桨叶。
图 4：通过一组用鬼笔环肽染色的 F-肌动蛋白染色的单个成熟晶状体纤维细胞的 3D 共聚焦 z 堆栈的正交 2D 投影（XY、XZ 和 YZ 平面）。 两个细胞被伪着为粉红色或绿色，以便在每个平面上进行识别。在 XY 平面中，粉红色单元格的短边朝上，而绿色单元格平躺，宽边朝上。在XZ平面中，观察到粉红色单元在方向上倾斜，而绿色单元与载玻片平行。在YZ平面上，观察到粉红色细胞的桨状和突起，证实该细胞是成熟的纤维细胞。比例尺 = 5 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
由于纤维的厚度约为2-4 μm 25,31，因此可以通过收集 z 堆栈来查看细胞表面或穿过细胞质的平面（图 5）。这在几乎与盖玻片平行的细胞上效果最好，细胞的宽边朝上。通过观察WGA信号，可以了解这种成熟纤维电池中的细胞表面（图5A）。XZ 平面清楚地表明该 XY 平面沿单元的宽边。沿膜的小 WGA+ 点状体表明细胞表面形态粗糙。在低曝光图像中，沿短边的小突起显示出非常丰富的F-肌动蛋白信号。在较高的暴露下，突起中的F-肌动蛋白信号饱和，在细胞膜上观察到细小的网状F-肌动蛋白网络（星号）。当考虑通过成熟纤维的细胞质（图5B）的XY平面时，主要沿细胞膜观察到WGA染色。与在细胞表面看到的类似，F-肌动蛋白富集于沿短边的突起中，在较高的暴露下可见网状细胞质F-肌动蛋白网络（星号）。我们之前的工作已经显示了通过细胞质22,23 在 XY 平面上对膜蛋白的染色，但使用这种方法，也可以沿着宽侧细胞表面定位蛋白质。
图 5：通过用 WGA（绿色）和鬼笔环肽（F-肌动蛋白，红色）染色的单个成熟纤维细胞的 3D 共聚焦 z 堆叠的正交 2D 投影（XY 和 XZ 平面）。 （A）细胞表面沿宽边的突起显示沿细胞膜的WGA，WGA的点状表明膜并不完全光滑。F-肌动蛋白富集于沿短边的突起中，F-肌动蛋白染色的高曝光图像显示沿细胞膜的网状网络（星号）。（B）通过同一细胞的细胞质的另一个平面显示沿细胞膜的WGA，框住细胞。F-肌动蛋白通过细胞质（星号）形成网状网络，并在沿细胞膜的突起中大量富集。比例尺 = 5 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
接下来，比较扫描电镜（SEM）和染色实验的晶状体纤维图像。SEM实验如前所述29进行，并且从样品中心到外围依次拍摄图像。首先，检查沿其短边具有小突起（图6，箭头）和沿其宽边具有球窝（箭头）的透镜纤维。与SEM图像（图6A）类似，在沿其短边定向的一束分化纤维中，球窝交叉是沿着细胞宽边延伸的大突起和凹槽（图6B，箭头）。当在单个分化的透镜光纤中观察 XY 和 XZ 正交 2D 投影中的单元时，会发现一个插座（图 6C，箭头）。与SEM图像（箭头）中的突起相比，沿短边的小互锁突起也忠实地保留在这些染色晶状体纤维细胞中。接下来，研究成熟纤维细胞的形态（图7）。在SEM图像和染色细胞中，沿着细胞的宽边有小凹陷（图7A，B，箭头）。据推测，这些是在成熟过程中缩小的球窝交叉的残余物。由小互锁突起（箭头）装饰的大桨（星号）在 SEM 中的细胞和染色的成熟纤维之间具有可比性。SEM图像中的细胞也有明显的凹槽，其中互锁突起停靠在细胞膜中（图7C，箭头）。这些凹槽也可以在这些染色的细胞中看到，并由WGA信号填充（图7D，箭头）。凹槽可能看起来像向内朝向细胞质的突起，而不是从细胞膜向外突出，并且通常只有 WGA 染色在几乎没有 F-肌动蛋白染色信号（如果有的话）的凹槽中可见。
图 6：从晶状体皮层分化纤维细胞的 SEM 和共聚焦显微镜图像。 用WGA（绿色）和鬼笔环肽（F-肌动蛋白，红色）对用于共聚焦显微镜的纤维细胞进行染色。（A） 一束分化晶状体纤维的 SEM 显示沿细胞宽边的球窝交叉（箭头），沿细胞的短边有小的互锁突起（箭头）。（B）从短边成像的一束分化纤维的共聚焦图像显示沿细胞宽边（箭头）的大球窝交叉。（C） 通过单个分化透镜光纤的正交 2D 投影（XY 和 XZ 平面）沿宽边显示球窝交叉（箭头），沿短边显示小的互锁突起（箭头）。比例尺 = 5 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：来自晶状体皮层的成熟纤维细胞的 SEM 和共聚焦显微镜图像。 用WGA（绿色）和鬼笔环肽（F-肌动蛋白，红色）对用于共聚焦显微镜的纤维细胞进行染色。（A） SEM图像有两根互锁的成熟纤维，桨状（星号）沿细胞的短边装饰着小突起（箭头）。沿着细胞的宽边也有小凹痕（箭头）。这些可能是球窝突起的缩小残余物。比例尺 = 5 μm。 （B） 通过单个成熟透镜光纤的正交 2D 投影（XY 和 XZ 平面）沿细胞的短边具有互锁的大桨（星号）和小突起（箭头）。小的WGA+环（箭头），类似于SEM图像中的压痕，沿着细胞的宽边可以看到。这些 WGA+ 结构没有 F-肌动蛋白染色。F-肌动蛋白主要富集在细胞膜的小突起中，在细胞质中具有弱网状染色模式。比例尺 = 5 μm。 （C） 成熟纤维的 SEM 图像显示细胞膜上有许多凹槽（箭头），相邻细胞的突起在这里休息和互锁。比例尺 = 2 μm。 （D） 一对刚刚分离的成熟纤维，显示被 WGA 染色的凹槽（箭头）。凹槽没有富集的 F-肌动蛋白染色，看起来像向内延伸到胞质溶胶的突起，而不是作为互锁结构向外延伸。比例尺 = 5 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
最后，将染色的核晶状体纤维与SEM制剂的图像进行比较。这种固定和染色核晶状体光纤的新方法忠实地保留了晶状体不同区域的核晶状体光纤的形态（图8）。核纤维电池沿其短边（箭头）具有不常见且较大的互锁突起。最外层的核晶状体纤维具有粗糙的细胞膜纹理，如SEM和染色细胞图像所示。当细胞向细胞核中心进一步压实时，沿细胞膜出现榫槽状交叉（星号），最内层的核纤维具有球状膜形态，可以在 SEM 图像和 WGA 染色中发现。F-肌动蛋白不再在细胞膜上富集，而是形成一个充满细胞质的网络，并微弱地延伸到突起中。
图 8：核晶状体纤维细胞的 SEM 和共聚焦显微镜图像。 用WGA（绿色）和鬼笔环肽（F-肌动蛋白，红色）对用于共聚焦显微镜的纤维细胞进行染色。（A）从最外层到晶状体中心的核纤维的SEM图像显示细胞短边上不常见且较大的互锁突起（箭头）。这些细胞的细胞膜粗糙，最内层细胞有榫槽状指（星号）和球状膜形态。（B） 通过单核透镜纤维对共聚焦 z 堆栈进行 3D 重建具有与 SEM 图像相当的特征，包括沿短边的突起（箭头）、榫槽状交叉（星号）和 WGA 染色可见的粗糙膜形态。F-肌动蛋白形成一个网络，填充细胞质并微弱地延伸到突起中。比例尺 = 5 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该方案已经证明了固定，保存和免疫染色方法，这些方法忠实地保留了晶状体中不同深度的束或单个晶状体纤维细胞的3D膜形态。将染色的晶状体纤维与长期用于研究晶状体纤维细胞形态的SEM制剂进行比较。结果表明，两种制剂之间的膜结构相当。EM 仍然是研究细胞形态的金标准，但在 SEM 样品中定位蛋白质33、34、35 的免疫标记更具挑战性，并且需要使用电子显微镜进行成像。这种免疫染色方法的优点是可以一次标记多个靶标，并在共聚焦显微镜上收集图像。
虽然该方法保留了复杂的细胞形态，但仍需要 SEM 来比较由于基因突变、衰老、药物治疗等原因导致的对照晶状体纤维和改变的晶状体纤维之间的指间。免疫染色制剂产生来自晶状体皮层或细胞核的细胞混合物，这些细胞随机分布在载玻片上。因此，如果细胞的形态改变，则可能更难辨别细胞在解离染色之前位于晶状体中的深度。在这些情况下，可能需要在固定和染色较小的晶状体纤维束后进一步将晶状体解剖成感兴趣的区域，以获得更高的空间精度。染色结果还应与SEM图像进行比较，以确保免疫染色的纤维保留改变细胞的形态。
首次表明，使用这种新创建的方法也可以保存核纤维细胞进行染色。在固定晶状体核之前去除晶状体皮层很重要，因为在固定整个晶状体时，固定剂穿透力不会到达晶状体核27。该协议分离晶状体核的方法描述了较软的皮质晶状体纤维的机械去除。这在啮齿动物晶状体中是可能的，因为晶状体核非常坚硬和紧凑 28,30,36。在其他物种中，晶状体细胞核较软，可能需要其他方法来分离这些细胞进行染色。以前，涡旋方法用于从具有较软晶状体核的敲除小鼠系中去除皮质纤维细胞，该细胞系无法通过机械去除可靠地分离29。
虽然我们没有在这些代表性数据中证明一抗染色，但我们之前已经用一抗和适当的二抗进行了相同类型的染色22,23。根据我们的经验，许多膜蛋白具有点状信号，因此建议在皮质纤维中使用WGA或F-肌动蛋白或在核纤维中使用WGA来清晰地描绘细胞膜，以更好地定位细胞膜蛋白并识别细胞分化和成熟的每个阶段。WGA 或 F-肌动蛋白染色应位于可见通道（红色、绿色或蓝色）中，以使观察者能够轻松找到合适的细胞进行目镜成像。这种类型的膜染色还可以帮助识别固定、染色和封片过程中对细胞的任何损伤，以排除机械损伤的细胞。在这篇和之前的作品22,23中，很少观察到机械损伤的细胞。
这种方法需要耐心和系统地检查细胞以进行成像。乍一看，细胞的随机混合可能非常令人生畏，但通常可以找到处于最佳方向的细胞。该方法适用于从其他物种中分离出的透镜纤维。在较大的晶状体中，可以在免疫染色之前使用仔细的解剖来分离不同的细胞层。总之，这项研究创造了一种强大而可靠的方法来保存纤维束或单纤维细胞，以研究其复杂的形态并在这些特殊细胞中以 3D 形式定位蛋白质。这种独特的核纤维染色方案为晶状体中研究较少的中心纤维开辟了一个新的研究领域。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家眼科研究所的 R01 EY032056（至 CC）资助。作者感谢斯克里普斯研究核心显微镜设施的Theresa Fassel博士和Kimberly Vanderpool对电子显微镜图像的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
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