Präparation und Immunfluoreszenzfärbung von Bündeln und Einzelfaserzellen aus der Hirnrinde und dem Zellkern der Augenlinse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von peripheren, reifen und nukleären Augenlinsenfaserzellen für die Immunfluoreszenzfärbung, um komplexe Zell-zu-Zell-Vermischungen und die Membranarchitektur zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Linse ist ein transparentes und ellipsoides Organ in der vorderen Augenkammer, das seine Form ändert, um Licht fein auf die Netzhaut zu fokussieren und ein klares Bild zu erzeugen. Der Großteil dieses Gewebes besteht aus spezialisierten, differenzierten Faserzellen, die einen hexagonalen Querschnitt aufweisen und sich vom vorderen bis zum hinteren Pol der Linse erstrecken. Diese langen und dünnen Zellen stehen in engem Gegensatz zu benachbarten Zellen und haben komplexe Verflechtungen entlang der Länge der Zelle. Die spezialisierten ineinandergreifenden Strukturen sind für normale biomechanische Eigenschaften der Linse erforderlich und wurden mit elektronenmikroskopischen Techniken ausführlich beschrieben. Dieses Protokoll demonstriert die erste Methode zur Konservierung und Immunfärbung von Einzelzellen sowie Bündeln von Mauslinsenfaserzellen, um die detaillierte Lokalisierung von Proteinen in diesen komplex geformten Zellen zu ermöglichen. Die repräsentativen Daten zeigen eine Färbung der peripheren, differenzierenden, reifen und nukleären Faserzellen in allen Regionen der Linse. Diese Methode kann möglicherweise auf Faserzellen angewendet werden, die aus Linsen anderer Spezies isoliert wurden.

Einleitung

Die Linse ist ein klares und eiförmiges Gewebe in der vorderen Augenkammer, das aus zwei Zelltypen besteht, Epithel- und Faserzellen 1 (Abbildung 1). Es gibt eine Monoschicht von Epithelzellen, die die vordere Hemisphäre der Linse bedeckt. Faserzellen werden von Epithelzellen unterschieden und machen den Großteil der Linse aus. Die hochspezialisierten Faserzellen durchlaufen eine Elongations-, Differenzierungs- und Reifungsprogrammierung, die durch deutliche Veränderungen der Zellmembranmorphologie von der Linsenperipherie bis zum Linsenzentrum gekennzeichnet^ist 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12

Protokoll

Die Mäuse wurden auf der Grundlage eines Tierprotokolls versorgt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Indiana University Bloomington genehmigt wurde. Die Mäuse, die zur Generierung repräsentativer Daten verwendet wurden, waren Kontrolltiere (Wildtyp) mit dem C57BL6/J-Hintergrund, weiblich und 8-12 Wochen alt. Für dieses Experiment können sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet werden, da es sehr unwahrscheinlich ist, dass das Geschlecht der Mäuse das Ergebnis des Experiments beeinflusst.

1. Dissektion und Entkapselung der Linse

1. Euthanasie von Mäusen gemäß dem "Leitfaden für die P....

Ergebnisse

Linsenfaserzellen werden aus dem Linsenkortex (differenzierende Fasern und reife Fasern) und dem Zellkern hergestellt, und die Zellen werden mit Phalloidin für F-Aktin und WGA für die Zellmembran gefärbt. Eine Mischung aus Zellbündeln oder einzelnen Linsenfasern (Abbildung 3) wird beobachtet und abgebildet. In der Linsenrinde finden sich zwei Arten von Zellen (Abbildung 3A). Die differenzierenden Faserzellen in der Linsenperipherie sind gerade, mit sehr kleinen .......

Diskussion

Dieses Protokoll hat die Fixierungs-, Konservierungs- und Immunfärbemethoden demonstriert, die die 3D-Membranmorphologie von Bündeln oder einzelnen Linsenfaserzellen aus verschiedenen Tiefen in der Linse originalgetreu erhalten. Die gefärbten Linsenfasern werden mit REM-Präparaten verglichen, die seit langem zur Untersuchung der Zellmorphologie von Linsenfasern verwendet werden. Die Ergebnisse zeigen vergleichbare Membranstrukturen zwischen beiden Präparaten. EM ist nach wie vor der Goldstandard für die Untersuchung der .......

Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm Platte	FisherScientific	FB0875713A
16% Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphat gepufferter Saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphat gepufferter Saline	ThermoFisher	14190136
48-Well Platte	CytoOne	CC7672-7548
Deckgläser (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Gebogene Pinzette	World Precision Instruments	501981
Dissektionsmikroskop	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Feinspitze gerade Pinzette	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop-Objektträger	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 Konfokalmikroskop mit Airyscan (63X) und Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nagellack
Normales Eselserum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (Rhodamin)	ThermoFisher	R415
Primärantikörper
Scalpel Feder Einweg, steril, Nr. 11	VWR	76241-186
Sekundärantikörper
Gerade Zange	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (Seziertray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-feines Skalpell	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Montagemittel mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Weizenkeim Agglutinin (Fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5

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