Summary
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von peripheren, reifen und nukleären Augenlinsenfaserzellen für die Immunfluoreszenzfärbung, um komplexe Zell-zu-Zell-Vermischungen und die Membranarchitektur zu untersuchen.
Abstract
Die Linse ist ein transparentes und ellipsoides Organ in der vorderen Augenkammer, das seine Form ändert, um Licht fein auf die Netzhaut zu fokussieren und ein klares Bild zu erzeugen. Der Großteil dieses Gewebes besteht aus spezialisierten, differenzierten Faserzellen, die einen hexagonalen Querschnitt aufweisen und sich vom vorderen bis zum hinteren Pol der Linse erstrecken. Diese langen und dünnen Zellen stehen in engem Gegensatz zu benachbarten Zellen und haben komplexe Verflechtungen entlang der Länge der Zelle. Die spezialisierten ineinandergreifenden Strukturen sind für normale biomechanische Eigenschaften der Linse erforderlich und wurden mit elektronenmikroskopischen Techniken ausführlich beschrieben. Dieses Protokoll demonstriert die erste Methode zur Konservierung und Immunfärbung von Einzelzellen sowie Bündeln von Mauslinsenfaserzellen, um die detaillierte Lokalisierung von Proteinen in diesen komplex geformten Zellen zu ermöglichen. Die repräsentativen Daten zeigen eine Färbung der peripheren, differenzierenden, reifen und nukleären Faserzellen in allen Regionen der Linse. Diese Methode kann möglicherweise auf Faserzellen angewendet werden, die aus Linsen anderer Spezies isoliert wurden.
Introduction
Die Linse ist ein klares und eiförmiges Gewebe in der vorderen Augenkammer, das aus zwei Zelltypen besteht, Epithel- und Faserzellen 1 (Abbildung 1). Es gibt eine Monoschicht von Epithelzellen, die die vordere Hemisphäre der Linse bedeckt. Faserzellen werden von Epithelzellen unterschieden und machen den Großteil der Linse aus. Die hochspezialisierten Faserzellen durchlaufen eine Elongations-, Differenzierungs- und Reifungsprogrammierung, die durch deutliche Veränderungen der Zellmembranmorphologie von der Linsenperipherie bis zum Linsenzentrum gekennzeichnetist 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , auch bekannt als Linsenkern. Die Funktion der Linse, Licht aus verschiedenen Entfernungen auf die Netzhaut zu fokussieren, hängt von ihren biomechanischen Eigenschaften ab, einschließlich Steifigkeit und Elastizität 13,14,15,16,17,18,19. Die komplexen Verzahnungen von Linsenfasern wurden hypothetisch aufgestellt20,21 und haben kürzlich gezeigt, dass sie für die Linsensteifigkeitwichtig sind 22,23.
Abbildung 1: Linsenanatomiediagramme und repräsentative Rasterelektronenmikroskopie-Aufnahmen (REM) von Linsenfasern. Die Karikatur zeigt eine Längsansicht (von oben nach hinten von oben nach unten) der vorderen Monoschicht von Epithelzellen (hellblau schattiert) und einer Masse von Linsenfaserzellen (weiß). Das Zentrum der Linse (rosa schattiert) wird als Zellkern bezeichnet und besteht aus hochverdichteten Faserzellen. Auf der rechten Seite zeigt ein Querschnitts-Cartoon die längliche sechseckige Zellform von Linsenfasern, die in ein Wabenmuster gepackt sind. Faserzellen haben zwei breite Seiten und vier kurze Seiten. Repräsentative REM-Bilder entlang der Unterseite zeigen die komplexen Membranverflechtungen zwischen Linsenfaserzellen in verschiedenen Tiefen der Linse. Von rechts haben neu gebildete Linsenfasern an der Linsenperipherie kleine Ausstülpungen an den kurzen Seiten und Kugeln an der Breitseite (rote Kästchen). Während der Reifung entwickeln Linsenfasern große Paddeldomänen, die durch kleine Ausstülpungen entlang der kurzen Seiten (blaue Kästchen) verziert sind. Reife Faserzellen besitzen große Paddeldomänen, die durch kleine Ausstülpungen gekennzeichnet sind. Diese ineinandergreifenden Domänen sind wichtig für die biomechanischen Eigenschaften von Linsen. Faserzellen im Linsenkern haben weniger kleine Ausstülpungen entlang ihrer kurzen Seiten und haben komplexe Nut-Feder-Verflechtungen (violette Kästchen). Die Breitseiten der Zelle weisen eine globuläre Membranmorphologie auf. Die Karikatur wurde von22,32 modifiziert und nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Maßstabsleiste = 3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Linse wächst durch Hinzufügen von Schalen aus neuen Faserzellen, die über frühere Generationen von Fasern24,25 gelegt werden. Faserzellen haben eine längliche, sechseckige Querschnittsform mit zwei breiten Seiten und vier kurzen Seiten. Diese Zellen erstrecken sich vom vorderen zum hinteren Pol der Linse, und je nach Art können die Linsenfasern mehrere Millimeter lang sein. Um die Struktur dieser länglichen und dünnen Zellen zu unterstützen, schaffen spezielle Verflechtungen entlang der breiten und kurzen Seiten ineinandergreifende Strukturen, um die Linsenform und die biomechanischen Eigenschaften zu erhalten. Veränderungen der Zellmembranform während der Differenzierung und Reifung von Faserzellen wurden durch elektronenmikroskopische (EM) Studien umfassend dokumentiert 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Neu gebildete Faserzellen haben Kugeln und Pfannen entlang ihrer breiten Seiten mit sehr kleinen Vorsprüngen entlang ihrer kurzen Seiten, während reife Fasern ineinandergreifende Vorsprünge und Paddel entlang ihrer kurzen Seiten haben. Kernfasern weisen Nut-Feder-Verflechtungen und eine globuläre Membranmorphologie auf. Über die Proteine, die für diese komplexen ineinandergreifenden Membranen benötigt werden, ist wenig bekannt. Bisherige Studien zur Proteinlokalisierung in Faserzellen stützten sich auf Linsengewebeschnitte, die keine eindeutige Visualisierung der komplexen Zellarchitektur ermöglichen.
In dieser Arbeit wurde eine neuartige Methode entwickelt und perfektioniert, um einzelne und Bündel von Linsenfaserzellen zu fixieren, um die komplexe Morphologie zu erhalten und die Immunfärbung von Proteinen an der Zellmembran und im Zytoplasma zu ermöglichen. Diese Methode bewahrt die Zellmembranarchitektur, vergleichbar mit Daten aus EM-Studien, und ermöglicht die Färbung mit primären Antikörpern für spezifische Proteine. Wir haben zuvor immungefärbte kortikale Linsenfasern in Differenzierung und Reifung22,23. In diesem Protokoll gibt es auch eine neue Methode zur Färbung von Faserzellen aus dem Linsenkern. Dieses Protokoll öffnet die Tür zum Verständnis der Mechanismen für die Bildung und Veränderung der Membraninterdigitation während der Reifung von Faserzellen und der Verdichtung des Linsenkerns.
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Protocol
Die Mäuse wurden auf der Grundlage eines Tierprotokolls versorgt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Indiana University Bloomington genehmigt wurde. Die Mäuse, die zur Generierung repräsentativer Daten verwendet wurden, waren Kontrolltiere (Wildtyp) mit dem C57BL6/J-Hintergrund, weiblich und 8-12 Wochen alt. Für dieses Experiment können sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet werden, da es sehr unwahrscheinlich ist, dass das Geschlecht der Mäuse das Ergebnis des Experiments beeinflusst.
1. Dissektion und Entkapselung der Linse
- Euthanasie von Mäusen gemäß dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" der National Institutes of Health sowie den von der Einrichtung genehmigten Tierverwendungsprotokollen.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden Mäuse durch eine CO2 -Überdosierung mit anschließender Gebärmutterhalsverrenkung in Übereinstimmung mit einem zugelassenen Tierprotokoll (Indiana University) euthanasiert. - Enukleieren Sie die Augen der Mäuse mit einer gebogenen Pinzette, indem Sie das Gewebe um die Augen herum mit einer Seite der Zange eindrücken, um das Auge aus der Augenhöhle zu verschieben. Schließen Sie dann die Pinzette unter dem Auge und heben Sie sie an, um das Auge aus der Augenhöhle zu entfernen. Übertragen Sie die Augen auf frische 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Dissektionsschiene.
- Schneiden Sie den Sehnerv mit einer ultrafeinen Schere so nah wie möglich am Augapfel ab. Führen Sie vorsichtig eine feine, gerade Pinzette durch den Ausgang des Sehnervs an der Rückseite des Auges in den Augapfel ein.
- Führen Sie die Schere vorsichtig an der gleichen Stelle wie die Pinzette in Schritt 1.3 ein und beginnen Sie mit dem Schneiden eines Schnitts von der Seitenzahnseite in Richtung der Hornhaut-Sklera-Verbindung.
HINWEIS: Nagetierlinsen nehmen ~30% ihrer Augen ein. Versehentliche Schäden entstehen, wenn die Pinzette oder Schere zu tief in das Auge eingeführt wird. - Fahren Sie mit dem Schnitt entlang des Hornhaut-Sklera-Übergangs fort, bis mindestens die Hälfte des Übergangs getrennt ist.
- Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf die Hornhaut, damit die Linse durch den mit den Schritten 1.4 und 1.5 vorgenommenen Einschnitt austreten kann.
- Entfernen Sie vorsichtig große Gewebestücke mit einer feinen Pinzette von der Linse. Untersuchen Sie das Objektiv, um die Äquatorregion zu finden.
- Stechen Sie die Linse mit einer geraden Pinzette mit feiner Spitze flach ein und entfernen Sie dann die Linsenkapsel. Die Masse der Linsenfaserzellen bleibt intakt und die Monoschicht des Linsenepithels bleibt an der Linsenkapsel haften. Entsorgen Sie die Linsenkapsel.
2. Linsen-Einzelfaser-Zellfärbung
- Die Zellmasse der Linsenfasern wird in eine Well-Platte mit 500 μl frisch hergestellter 1%iger Paraformaldehyd-Lösung (PFA; in 1x PBS) überführt und die Proben über Nacht bei 4 °C mit sanfter Nutenation inkubiert (Abbildung 2A).
HINWEIS: Die Volumina für die angegebenen Lösungen sind für 48-Well-Platten optimiert. Wenn Well-Platten oder Röhrchen anderer Größe verwendet werden, passen Sie das Volumen der Lösungen entsprechend an. Fixierungs-, Blockierungs- und Waschlösungen (1x PTX, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) wurden mit 10x PBS und doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) bis zu einer Endkonzentration von 1x PBS hergestellt. - Übertragen Sie die Linsenfaserzellen in eine 60-mm-Schale mit 1 % PFA. Verwenden Sie ein scharfes Skalpell, um den Ball aus Faserzellen entlang seiner vorderen und hinteren Achse in zwei Hälften zu teilen (Abbildung 2B). Die Hälften entlang der gleichen Achse noch einmal halbieren, um Viertel zu erhalten.
HINWEIS: Die vordere-posteriore Achse ist leicht an der Richtung der Faserzellen in der Gewebemasse zu erkennen. - Verwenden Sie eine gerade Pinzette, um die Kernregion aus den Zellvierteln der Linsenfasern zu entfernen (Abbildung 2C).
HINWEIS: Die Linsenkernregion ist bei Nagetierlinsen starr, und die Mitte der Linse löst sich leicht von den weicheren kortikalen Fasern. - Fixieren Sie die Viertel der Linsenkortexregion in 200 μl 1 % PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) mit leichtem Schütteln (300 U/min auf einem Plattenschüttler).
- Waschen Sie die Gewebeviertel zweimal in 750 μl 1x PBS für jeweils 5 min mit leichtem Schütteln bei RT.
- Blockieren Sie die Proben mit 200 μl Blockierungslösung (5 % Serum, 0,3 % Triton X-100, 1x PBS) für 1 h bei RT mit leichtem Schütteln.
HINWEIS: Für die repräsentativen Daten in diesem Protokoll wurden die Proben nicht mit primären oder sekundären Antikörpern gefärbt. Nach dem Blockierungsschritt wurden die Proben mit Weizenkeimagglutinin (WGA; 1:100) und Phalloidin (1:100) (siehe Materialtabelle) für 3 h bei RT mit leichtem Schütteln und Lichtschutz inkubiert. Die Färbung von Primärantikörpern wurde in früheren Publikationennachgewiesen 22,23. - Mit 100 μl Primärantikörperlösung über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
HINWEIS: Die Antikörper werden in Blockierungslösung verdünnt. Im Vergleich zu Objektträgern mit Gewebeschnitten befinden sich bei dieser Art der Präparation mehr Zellen. Die Konzentrationen der primären Antikörper sollten erhöht werden, um ausreichend Antikörper für die Färbung weiterer Zellen bereitzustellen. Es wird empfohlen, die Antikörperkonzentration im Vergleich zu dem, was auf Gewebeschnitten verwendet wird, zu verdoppeln. Gleiches gilt für Sekundärantikörper. - Waschen Sie die Gewebeviertel dreimal mit 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) für jeweils 5 min bei RT unter leichtem Schütteln.
- Inkubieren Sie die Faserzellen mit 100 μl sekundärer Antikörper-/Farbstofflösung für 3 h bei RT unter leichtem Schütteln. Schützen Sie die Proben bei diesem und den folgenden Schritten vor Licht.
HINWEIS: WGA, Phalloidin und andere Fluoreszenzfarbstoffe können der sekundären Antikörperlösung zugesetzt werden, um gleichzeitig die Zellmembran, das Zytoskelett oder andere Organellen zu markieren und gleichzeitig den primären Antikörper zu markieren. - Waschen Sie die Faserzellen viermal mit 1x PTX für jeweils 5 min bei RT mit leichtem Schütteln.
- Geben Sie einen Tropfen oder 50 μl Eindeckmedium auf einen gut geladenen Objektträger, bevor Sie die Gewebeviertel auf den Objektträger übertragen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Faserzellen vorsichtig voneinander zu trennen und versuchen Sie, die Überlappung der Zellbündel zu begrenzen.
- Tragen Sie vorsichtig ein Deckglas #1.5 auf die Probe in Eindeckmedien auf. Das Eindeckmedium sollte sich bis zum Rand des Deckglases ausbreiten. Wenn dies nicht der Fall ist, fügen Sie zusätzliche Eindeckmedien an den Rand des Deckglases hinzu. Saugen Sie überschüssiges Eindeckmaterial am Rand des Deckglases ab und verwenden Sie Nagellack, um die Kanten des Deckglases auf dem Objektträger zu versiegeln.
HINWEIS: Jede Art von Eindeckmedium, das für die konfokale Mikroskopie formuliert ist, kann für diese Experimente verwendet werden.
3. Färbung von Linsenkern-Einzelfaserzellen
- Schließen Sie die in Abschnitt 1 beschriebene Sektion ab.
- Entfernen Sie mechanisch die kortikalen Fasern von der Kugel der Linsenfaserzellen, wobei Sie den Linsenkern verlassen, indem Sie die Faserzellmasse vorsichtig auf nasse, behandschuhte Fingerspitzen übertragen und die Gewebemasse vorsichtig rollen.
ANMERKUNG: Bei Mäuselinsen ist das Rollen der Kugel von Linsenfaserzellen zwischen behandschuhten Fingerspitzen eine wirksame Methode zur Entfernung der kortikalen Faserzellen aus dem harten Linsenkern28,30. Bei Linsen, bei denen dieses mechanische Verfahren nicht wirksam ist, kann eine sorgfältige Dissektion oder ein Wirbelverfahren29 verwendet werden, um die kortikalen Faserzellen zu entfernen. - Den Linsenkern in eine frisch hergestellte 1%ige PFA-Lösung in eine Well-Platte überführen und über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
- Die Probe wird in eine 60-mm-Schale mit 1 % PFA gegeben und mit einem scharfen Skalpell der Linsenkern entlang der vorderen und hinteren Achse gespalten. Halbieren Sie die Gewebeproben erneut, um Zellkernviertel zu erhalten.
- Befolgen Sie das in den Schritten 2.4-2.13 beschriebene Verfahren für die Immunfärbung und die Probeneinbettung.
Abbildung 2: Grafische Zusammenfassung der Präparation und Immunfärbung von Linsenfaserzellen . (A) Diese 48-Well-Platte wurde nach Säulen farbcodiert, um einen Probenplattenaufbau für die beschriebenen Methoden zu demonstrieren, der einen einfachen Transfer von Proben zwischen den verschiedenen Immunfärbeschritten durch schonende Handhabung mit einer Pinzette ermöglicht. Während die repräsentativen Daten für dieses Protokoll nicht mit einem primären Antikörper inkubiert werden, enthält das Diagramm eine Spalte für die Inkubation von primären Antikörpern, und die Vertiefungen zum Waschen können wiederverwendet werden, nachdem verbrauchte Waschpuffer durch Aspiration entfernt wurden. (B) Nach der Fixierung der Zellmasse der Linsenfaser wird das Gewebe entlang der anterior-posterioren Achse gespalten (rote gestrichelte Linien), um die ursprüngliche Struktur der Zellen zu erhalten. Ist die Gewebemasse halbiert, werden die Proben gedreht und die Hälften entlang der vorder-posterioren Achse in Viertel geteilt (rote gestrichelte Linien). (C) Das Entfernen der Linsenkernregion (in rosa) kann einfach mit einer Pinzette durchgeführt werden, um das dichte zentrale Gewebe aus den kortikalen Faserzellen (in blau) herauszugraben. Cartoon-Diagramme wurden teilweise mit BioRender.com erstellt und nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Linsenfaserzellen werden aus dem Linsenkortex (differenzierende Fasern und reife Fasern) und dem Zellkern hergestellt, und die Zellen werden mit Phalloidin für F-Aktin und WGA für die Zellmembran gefärbt. Eine Mischung aus Zellbündeln oder einzelnen Linsenfasern (Abbildung 3) wird beobachtet und abgebildet. In der Linsenrinde finden sich zwei Arten von Zellen (Abbildung 3A). Die differenzierenden Faserzellen in der Linsenperipherie sind gerade, mit sehr kleinen Vorsprüngen entlang ihrer kurzen Seiten. Wenn sich die Zelle differenziert, werden die Faserzellen wellig mit kleinen, ineinandergreifenden Ausstülpungen. Darüber hinaus entwickeln die Faserzellen während des Reifungsprozesses große Paddel, die mit kleinen, ineinandergreifenden Vorsprüngen verziert sind. Der Linsenkern ist bei Mäuselinsen sehr kompakt und starr und wird durch mechanische Entfernung des weicheren Linsenkortex vor der Fixierung und Färbung der Kernlinsenfasern isoliert. Aus dem Linsenkern finden sich Bündel von Linsenfasern, die einen kleineren Durchmesser haben und feine Membranstrukturen aufweisen, die auf einem Bild mit geringer Vergrößerung nicht ohne weiteres zu erkennen sind.
In 3D-Rekonstruktionen von Linsenfaserzellen aus verschiedenen Regionen der Linse mit hoher Vergrößerung (Abbildung 3B) zeigt sich, dass F-Aktin und WGA in differenzierenden und reifen Faserzellen stark an der Zellmembran kolokalisiert sind. F-Aktin ist in den ineinandergreifenden Ausstülpungen entlang der Zellmembran in differenzierenden und reifen Fasern angereichert (Abbildung 3B, Pfeilspitzen). Reife Faserzellen entwickeln große, ineinandergreifende Paddel (Abbildung 3B, Sternchen). Die WGA-Färbung ist nicht vollständig mit dem F-Aktin-Signal kolokalisiert, insbesondere in der reifen Faserzelle, was darauf hindeutet, dass das kortikale Aktinnetzwerk nicht alle kleineren Strukturen entlang der Zellmembran unterstützt. Unerwarteterweise wird festgestellt, dass sich das F-Aktin-Netzwerk im Zytoplasma von Kernfaserzellen befindet. Während sich das F-Aktin-Signal in die Ausstülpungen (Abbildung 3B, Pfeile) entlang der Zellkernmembran erstreckt, ist das Aktinnetzwerk nicht mehr in der Nähe der Zellmembran oder innerhalb der Ausstülpungen angereichert. Der Morphologie der Kernfaserzelle fehlen Paddel, zusätzlich zu einer Abnahme der Organisation und Häufigkeit von Vorsprüngen.
Abbildung 3: Konfokale Bilder von Bündeln (niedrige Vergrößerung) und Einzelbilder (hohe Vergrößerung) von Faserzellen aus verschiedenen Regionen der Linse. Die Zellen werden mit WGA (Zellmembranen, grün), Phalloidin (F-Aktin, rot) und DAPI (Zellkerne, blau) gefärbt. (A) In diesen Präparaten finden sich häufig Bündel von Linsenfaserzellen aus verschiedenen Regionen. In den kortikalen Präparaten befinden sich differenzierende und reife Faserzellen. Diese verschiedenen Zellen haben unterschiedliche Morphologien, die eine einfache Identifizierung ermöglichen. In den Proben aus dem Linsenkern finden sich sowohl Faserzellbündel als auch dissoziierte Fasern. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Z-Stapel durch einzelne differenzierende, reife und nukleäre Faserzellen werden gesammelt, und 3D-Rendering wird verwendet, um die gezeigten Bilder zu rekonstruieren. Die differenzierenden und reifen Fasern haben viele kleine Ausstülpungen entlang ihrer kurzen Seiten (die Pfeilspitzen markieren ausgewählte). Diese kleinen Ausstülpungen sind mit F-Aktin angereichert. Die reife Faser hat auch große, ineinandergreifende Paddeldomänen (Sternchen). Die Kernfasern haben kleine Membrantaschen und Divots, die durch WGA gefärbt sind, und behalten einige Ausstülpungen entlang ihrer kurzen Seiten (Pfeile). Überraschenderweise ist das F-Aktin-Netzwerk nun im Zellzytoplasma verteilt, ohne dass Signale an der Zellmembran angereichert sind. Das F-Aktin-Netzwerk erstreckt sich in kleine Ausstülpungen. Maßstabsleiste = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Bei der Untersuchung der Faserzellen ist es wichtig, die Ausrichtung der Zellen zu beachten, um Verwirrung darüber zu vermeiden, welcher Zelltyp beobachtet wird. Z-Stapel werden durch die Zellen gesammelt, und dann wird die 3D-Rekonstruktion verwendet, um die orthogonalen 2D-Projektionen in den XY-, XZ- und YZ-Ebenen zu betrachten. Aufgrund der zufälligen Ausrichtung der Zellen in diesem Präparat ist es möglich, Zellen zu haben, die nicht perfekt flach auf dem Objektträger liegen (Abbildung 4). Alle Zellen in diesem repräsentativen Bild sind reife Linsenfasern, aber jede Zelle hat ein drastisch anderes Aussehen in der XY-Ebene. Die pseudofarbene Zelle in Grün ist mit der breiten Seite nach oben mit sichtbaren Paddeln und Vorsprüngen ausgerichtet, während die pseudogefärbte Zelle in Rosa mit der kurzen Seite nach oben liegt. Dies lässt sich leichter in der XZ-Ebene visualisieren, indem die senkrechten Orientierungen der beiden Zellen in der XY-Ebene angezeigt werden. Die Untersuchung der YZ-Ebene zeigt deutlich die Paddel der reifen Faser, die von der XY-Ebene rosa gefärbt ist.
Abbildung 4: Orthogonale 2D-Projektionen (XY-, XZ- und YZ-Ebenen) von konfokalen 3D-Z-Stapeln durch eine Gruppe einzelner reifer Linsenfaserzellen, die mit Phalloidin für F-Aktin gefärbt sind. Zwei Zellen sind zur Identifizierung auf jeder Ebene pseudorosa oder grün eingefärbt. In der XY-Ebene liegt die rosafarbene Zelle mit der kurzen Seite nach oben, während die grüne Zelle flach mit der breiten Seite nach oben liegt. In der XZ-Ebene wird beobachtet, dass die rosa Zelle in ihrer Ausrichtung geneigt ist, während die grüne Zelle parallel zum Objektträger verläuft. In der YZ-Ebene werden die Paddel und Ausstülpungen der rosa Zellen beobachtet, was bestätigt, dass es sich bei dieser Zelle um eine reife Faserzelle handelt. Maßstabsleiste = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Da die Fasern etwa 2-4 μm dick 25,31 sind, ist es durch die Ansammlung vonZ-Stapeln möglich, die Zelloberfläche oder eine Ebene durch das Zytoplasma zu betrachten (Abbildung 5). Dies funktioniert am besten bei Zellen, die fast parallel zum Deckglas sind, wobei die breite Seite der Zelle nach oben zeigt. Die Zelloberfläche in dieser reifen Faserzelle kann durch Beobachtung des WGA-Signals abgeschätzt werden (Abbildung 5A). Die XZ-Ebene zeigt deutlich, dass sich diese XY-Ebene entlang der Breitseite der Zelle befindet. Kleine WGA+-Punkte entlang der Membran deuten auf eine raue Zelloberflächenmorphologie hin. Die kleinen Ausstülpungen entlang der kurzen Seite zeigen in schwach belichteten Bildern ein stark angereichertes F-Aktin-Signal. Bei höherer Exposition, bei der das F-Aktin-Signal in den Ausstülpungen gesättigt ist, wird ein feines netzartiges F-Aktin-Netzwerk über die Zellmembran beobachtet (Sternchen). Wenn eine XY-Ebene durch das Zytoplasma der reifen Faser betrachtet wird (Abbildung 5B), wird die WGA-Färbung hauptsächlich entlang der Zellmembran beobachtet. Ähnlich wie an der Zelloberfläche ist F-Aktin in den Ausstülpungen entlang der kurzen Seiten angereichert, wobei ein retikuliertes zytoplasmatisches F-Aktin-Netzwerk bei höherer Exposition sichtbar ist (Sternchen). Unsere früheren Arbeiten haben die Färbung von Membranproteinen in XY-Ebenen durch das Zellzytoplasma22,23 gezeigt, aber mit dieser Methode ist es auch möglich, Proteine entlang der breiten Zelloberfläche zu lokalisieren.
Abbildung 5: Orthogonale 2D-Projektionen (XY- und XZ-Ebenen) von konfokalen 3D-Z-Stapeln durch eine einzelne reife Faserzelle, die mit WGA (grün) und Phalloidin (F-Aktin, rot) gefärbt ist. (A) Projektionen von der Zelloberfläche entlang der Breitseite zeigen WGA entlang der Zellmembran, und die Punkte von WGA deuten darauf hin, dass die Membran nicht vollständig glatt ist. F-Aktin ist in den Ausstülpungen entlang der kurzen Seiten angereichert, und ein hochbelichtetes Bild der F-Aktin-Färbung zeigt ein netzartiges Netzwerk entlang der Zellmembran (Sternchen). (B) Eine weitere Ebene durch das Zytoplasma derselben Zelle zeigt WGA entlang der Zellmembran und rahmt die Zelle ein. F-Aktin bildet ein netzartiges Netzwerk durch das Zytoplasma (Sternchen) und ist in den Ausstülpungen entlang der Zellmembran stark angereichert. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Als nächstes werden Bilder von Linsenfasern aus dem Scanning EM (REM) und Färbeexperimenten verglichen. REM-Experimente werden wie zuvor beschrieben29 durchgeführt, und die Bilder werden nacheinander von der Mitte der Probe zur Peripherie aufgenommen. Zunächst werden differenzierende Linsenfasern mit kleinen Vorsprüngen (Abbildung 6, Pfeile) entlang ihrer kurzen Seiten und einer Kugelpfanne (Pfeilspitzen) entlang ihrer Breitseiten untersucht. Ähnlich wie im REM-Bild (Abbildung 6A) sind die Kugel-und-Pfannen-Verflechtungen in einem Bündel differenzierender Fasern, die entlang ihrer kurzen Seiten orientiert sind, große Vorsprünge und Rillen, die sich entlang der Breitseite der Zellen erstrecken (Abbildung 6B, Pfeilspitzen). Eine Buchse wird gefunden (Abbildung 6C, Pfeilspitzen), wenn die Zelle in den orthogonalen XY- und XZ-2D-Projektionen in einzelnen differenzierenden Linsenfasern betrachtet wird. Kleine ineinandergreifende Ausstülpungen entlang der kurzen Seiten sind in diesen gefärbten Linsenfaserzellen im Vergleich zu denen im REM-Bild (Pfeile) ebenfalls originalgetreu erhalten. Als nächstes wird die Morphologie reifer Faserzellen untersucht (Abbildung 7). Im REM-Bild und in der gefärbten Zelle befinden sich kleine Divots entlang der Breitseite der Zellen (Abbildung 7A,B, Pfeilspitzen). Vermutlich handelt es sich dabei um die Überbleibsel der Kugelgelenkverflechtungen, die während des Reifeprozesses schrumpfen. Die großen Paddel (Sternchen), die mit kleinen ineinandergreifenden Ausstülpungen (Pfeilen) verziert sind, sind zwischen den Zellen im REM und der gefärbten reifen Faser vergleichbar. Die Zellen im REM-Bild haben auch deutliche Rillen, in denen ein ineinandergreifender Vorsprung in der Zellmembran andockt (Abbildung 7C, Pfeilspitzen). Diese Rillen sind auch in diesen gefärbten Zellen zu sehen und werden durch das WGA-Signal gefüllt (Abbildung 7D, Pfeilspitzen). Die Rillen können wie Ausstülpungen aussehen, die nach innen in Richtung Zellzytoplasma gehen, anstatt von der Zellmembran nach außen zu projizieren, und oft ist nur eine WGA-Färbung in den Rillen sichtbar, die nur ein sehr geringes, wenn überhaupt, F-Aktin-Färbesignal haben.
Abbildung 6: REM- und konfokalmikroskopische Aufnahmen von differenzierenden Faserzellen aus dem Linsenkortex. Faserzellen für die konfokale Mikroskopie werden mit WGA (grün) und Phalloidin (F-Aktin, rot) gefärbt. (A) Das REM eines Bündels differenzierender Linsenfasern zeigt Kugelgelenke (Pfeilspitzen) entlang der Breitseite der Zellen mit kleinen ineinandergreifenden Vorsprüngen (Pfeile) entlang der kurzen Seiten der Zellen. (B) Konfokale Bilder eines Bündels differenzierender Fasern, die von den kurzen Seiten aufgenommen wurden, zeigen große Kugelgelenkverflechtungen entlang der breiten Seiten der Zellen (Pfeilspitzen). (C) Orthogonale 2D-Projektionen (XY- und XZ-Ebenen) durch eine einzelne differenzierende Linsenfaser zeigen eine Kugel-und-Gelenk-Verzahnung (Pfeilspitzen) entlang der Breitseite und kleine ineinandergreifende Vorsprünge entlang der kurzen Seite (Pfeile). Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: REM- und konfokalmikroskopische Aufnahmen von reifen Faserzellen aus dem Linsenkortex. Faserzellen für die konfokale Mikroskopie werden mit WGA (grün) und Phalloidin (F-Aktin, rot) gefärbt. (A) Das REM-Bild zeigt zwei ineinandergreifende reife Fasern mit Paddeln (Sternchen), die durch kleine Ausstülpungen (Pfeile) entlang der kurzen Seiten der Zellen verziert sind. Es gibt auch kleine Vertiefungen (Pfeilspitzen) entlang der Breitseite der Zelle. Möglicherweise handelt es sich dabei um die schrumpfenden Reste von Kugelkopfvorsprüngen. Maßstabsbalken = 5 μm. (B) Orthogonale 2D-Projektionen (XY- und XZ-Ebenen) durch eine einzelne reife Linsenfaser haben ineinandergreifende große Paddel (Sternchen) und kleine Vorsprünge (Pfeile) entlang der kurzen Seiten der Zellen. Kleine WGA+-Ringe (Pfeilspitzen), ähnlich den Vertiefungen im REM-Bild, sind entlang der Breitseite der Zelle zu sehen. Diese WGA+-Strukturen weisen keine F-Aktin-Färbung auf. F-Aktin ist meist an der Zellmembran in den kleinen Ausstülpungen angereichert und hat ein schwaches retikuliertes Färbemuster im Zytoplasma. Maßstabsbalken = 5 μm. (C) REM-Aufnahme der reifen Fasern mit vielen Rillen in der Zellmembran (Pfeilspitzen), in denen Ausstülpungen der benachbarten Zellen aufliegen und ineinander greifen. Maßstabsbalken = 2 μm. (D) Ein Paar reifer Fasern, die gerade getrennt wurden und Rillen (Pfeilspitzen) aufweisen, die mit WGA gefärbt sind. Die Rillen weisen keine Anreicherung der F-Aktin-Färbung auf und sehen wie Ausstülpungen aus, die sich nach innen in Richtung Zytosol erstrecken, anstatt sich als ineinandergreifende Struktur nach außen zu erstrecken. Maßstabsleiste = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abschließend werden die gefärbten Kernlinsenfasern mit Bildern von REM-Präparaten verglichen. Diese neue Methode zur Fixierung und Färbung von Kernlinsenfasern bewahrt die Morphologie der Kernlinsenfasern in verschiedenen Bereichen der Linse originalgetreu (Abbildung 8). Kernfaserzellen haben seltene und größere, ineinandergreifende Vorsprünge entlang ihrer kurzen Seiten (Pfeile). Die äußersten Kernlinsenfasern haben eine raue Zellmembrantextur, wie sie sowohl in den REM- als auch in den gefärbten Zellbildern zu sehen ist. Wenn die Zellen in Richtung des Kernzentrums weiter verdichtet werden, treten entlang der Zellmembran Nut- und Federverflechtungen auf (Sternchen), und die innersten Kernfasern weisen eine globuläre Membranmorphologie auf, die auf dem REM-Bild und mit WGA-Färbung erkannt werden kann. F-Aktin wird nicht mehr an der Zellmembran angereichert, sondern bildet ein Netzwerk, das das Zytoplasma ausfüllt und sich schwach in die Ausstülpungen erstreckt.
Abbildung 8: REM- und konfokalmikroskopische Aufnahmen von Kernlinsenfaserzellen. Faserzellen für die konfokale Mikroskopie werden mit WGA (grün) und Phalloidin (F-Aktin, rot) gefärbt. (A) REM-Bilder von Kernfasern von den äußersten Schichten in Richtung Linsenmitte zeigen seltene und größere ineinandergreifende Vorsprünge an den kurzen Seiten der Zellen (Pfeile). Die Zellmembran ist in diesen Zellen rau, mit Nut-und-Feder-Verflechtungen (Sternchen) und globulärer Membranmorphologie in den innersten Zellen. (B) 3D-Rekonstruktionen von konfokalen Z-Stapeln durch einzelne Kernlinsenfasern weisen vergleichbare Merkmale wie die REM-Bilder auf, einschließlich Vorsprünge entlang der kurzen Seiten (Pfeile), Nut-Feder-Verflechtungen (Sternchen) und der rauen Membranmorphologie, die bei der WGA-Färbung sichtbar ist. F-Aktin bildet ein Netzwerk, das das Zytoplasma der Zelle ausfüllt und sich schwach in die Ausstülpungen erstreckt. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll hat die Fixierungs-, Konservierungs- und Immunfärbemethoden demonstriert, die die 3D-Membranmorphologie von Bündeln oder einzelnen Linsenfaserzellen aus verschiedenen Tiefen in der Linse originalgetreu erhalten. Die gefärbten Linsenfasern werden mit REM-Präparaten verglichen, die seit langem zur Untersuchung der Zellmorphologie von Linsenfasern verwendet werden. Die Ergebnisse zeigen vergleichbare Membranstrukturen zwischen beiden Präparaten. EM ist nach wie vor der Goldstandard für die Untersuchung der Zellmorphologie, aber die Immunmarkierung ist in REM-Proben zur Lokalisierung von Proteinen33,34,35 schwieriger und erfordert eine Abbildung mit einem Elektronenmikroskop. Der Vorteil dieser Immunfärbemethode besteht darin, dass mehrere Ziele gleichzeitig markiert werden können und die Bilder auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen werden.
Während die Methode die komplexe Zellmorphologie bewahrt, ist das SEM immer noch erforderlich, um die Vermischungen zwischen Kontroll- und veränderten Linsenfasern aufgrund genetischer Mutationen, Alterung, pharmazeutischer Behandlungen usw. zu vergleichen. Das Immunfärbepräparat erzeugt eine Mischung aus Zellen aus der Linsenrinde oder dem Zellkern, die zufällig auf dem Objektträger verteilt sind. Wenn also die Morphologie der Zellen verändert ist, kann es schwieriger sein, die Tiefe zu erkennen, in der sich die Zellen vor der Dissoziation für die Färbung in der Linse befanden. In diesen Fällen kann es notwendig sein, die Linse nach der Fixierung und Färbung kleinerer Bündel von Linsenfasern weiter in interessante Bereiche zu zerlegen, um eine höhere räumliche Genauigkeit zu erzielen. Die Färbeergebnisse sollten auch mit REM-Bildern verglichen werden, um sicherzustellen, dass die immungefärbten Fasern die Morphologie der veränderten Zellen erhalten.
Es konnte erstmals gezeigt werden, dass mit dieser neu geschaffenen Methode auch Kernfaserzellen für die Färbung konserviert werden können. Es ist wichtig, den Linsenkortex vor der Fixierung des Zellkerns zu entfernen, da die fixierende Penetration den Linsenkern nicht erreicht, wenn die gesamte Linse27 fixiert wird. Die Methode dieses Protokolls zur Isolierung des Linsenkerns beschreibt die mechanische Entfernung weicherer kortikaler Linsenfasern. Dies ist bei Nagetierlinsen aufgrund des sehr harten und kompakten Linsenkerns 28,30,36 möglich. Bei anderen Spezies ist der Linsenkern weicher und erfordert möglicherweise andere Methoden, um diese Zellen für die Färbung zu isolieren. Zuvor wurde eine Vortexing-Methode verwendet, um kortikale Faserzellen aus einer Knockout-Mauslinie mit einem weicheren Linsenkern zu entfernen, der durch mechanische Entfernung nicht zuverlässig isoliert werden konnte29.
Obwohl wir in diesen repräsentativen Daten keine Primärantikörperfärbung nachweisen konnten, haben wir zuvor die gleiche Art der Färbung mit Primärantikörpern und geeigneten Sekundärantikörpern durchgeführt22,23. Unserer Erfahrung nach haben viele der Membranproteine ein punktförmiges Signal, und daher wird die Verwendung von WGA oder F-Aktin in kortikalen Fasern oder WGA in Kernfasern empfohlen, um die Zellmembran klar abzugrenzen, um Zellmembranproteine besser zu lokalisieren und jedes Stadium der Zelldifferenzierung und -reifung zu erkennen. Die WGA- oder F-Aktin-Färbung sollte in einem sichtbaren Kanal (rot, grün oder blau) erfolgen, damit der Beobachter die geeigneten Zellen für die Bildgebung mit dem Okular leicht finden kann. Diese Art der Membranfärbung kann auch dazu beitragen, Schäden an den Zellen durch den Fixierungs-, Färbe- und Montageprozess zu identifizieren, um mechanisch beschädigte Zellen auszuschließen. In dieser und früheren Arbeiten22,23 werden mechanisch geschädigte Zellen nur selten beobachtet.
Diese Methode erfordert eine geduldige und systematische Untersuchung der Zellen für die Bildgebung. Die zufällige Mischung von Zellen kann auf den ersten Blick ziemlich abschreckend sein, aber in der Regel lassen sich Zellen finden, die in der optimalen Ausrichtung liegen. Diese Methode könnte für Linsenfasern adaptiert werden, die von anderen Spezies isoliert wurden. Bei größeren Linsen kann es möglich sein, die verschiedenen Zellschichten vor der Immunfärbung durch sorgfältige Dissektion zu trennen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine robuste und zuverlässige Methode entwickelt hat, um Bündel von Fasern oder Einzelfaserzellen zu konservieren, um ihre komplexe Morphologie zu untersuchen und Proteine in 3D in diesen spezialisierten Zellen zu lokalisieren. Dieses einzigartige Protokoll für die Färbung von Kernfasern eröffnet ein neues Forschungsgebiet für die weniger gut untersuchten zentralen Fasern der Linse.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium R01 EY032056 (an CC) des National Eye Institute unterstützt. Die Autoren danken Dr. Theresa Fassel und Kimberly Vanderpool von der Scripps Research Core Microscopy Facility für ihre Unterstützung bei den elektronenmikroskopischen Bildern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
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