Summary
Dit protocol beschrijft methoden om perifere, volwassen en nucleaire ooglensvezelcellen voor te bereiden op immunofluorescentiekleuring om complexe cel-tot-cel-interdigitaties en de membraanarchitectuur te bestuderen.
Abstract
De lens is een transparant en ellipsoïde orgaan in de voorste oogkamer dat van vorm verandert om het licht fijn op het netvlies te richten om een helder beeld te vormen. Het grootste deel van dit weefsel bestaat uit gespecialiseerde, gedifferentieerde vezelcellen die een zeshoekige doorsnede hebben en zich uitstrekken van de voorste tot de achterste polen van de lens. Deze lange en dunne cellen staan sterk tegenover naburige cellen en hebben complexe interdigitaties over de lengte van de cel. De gespecialiseerde in elkaar grijpende structuren zijn vereist voor normale biomechanische eigenschappen van de lens en zijn uitgebreid beschreven met behulp van elektronenmicroscopietechnieken. Dit protocol demonstreert de eerste methode om enkelvoud en bundels van muizenlensvezelcellen te behouden en te immunokleuren om de gedetailleerde lokalisatie van eiwitten in deze complex gevormde cellen mogelijk te maken. De representatieve gegevens tonen kleuring van de perifere, differentiërende, rijpe en nucleaire vezelcellen in alle regio's van de lens. Deze methode kan mogelijk worden gebruikt op vezelcellen die zijn geïsoleerd uit lenzen van andere soorten.
Introduction
De lens is een helder en eivormig weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee celtypen, epitheel- en vezelcellen 1 (Figuur 1). Er is een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekt. Vezelcellen worden onderscheiden van epitheelcellen en vormen het grootste deel van de lens. De zeer gespecialiseerde vezelcellen ondergaan een verlenging, differentiatie en rijpingsprogrammering, gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de morfologie van het celmembraan van de lensperiferie naar het lenscentrum 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , ook wel bekend als de lenskern. De functie van de lens om licht dat van verschillende afstanden op het netvlies komt fijn te focussen, hangt af van de biomechanische eigenschappen ervan, waaronder stijfheid en elasticiteit 13,14,15,16,17,18,19. De complexe interdigitaties van lensvezels zijn verondersteld20,21 en onlangs is aangetoond dat ze belangrijk zijn voor lensstijfheid22,23.
Figuur 1: Lensanatomiediagrammen en representatieve scanning-elektronenmicroscopie (SEM)-beelden van lensvezels. De cartoon toont een longitudinaal (van voren naar achteren van boven naar beneden) weergave van de voorste monolaag van epitheelcellen (lichtblauw gearceerd) en een bulkmassa lensvezelcellen (wit). Het midden van de lens (roze gearceerd) staat bekend als de kern en bestaat uit sterk verdichte vezelcellen. Aan de rechterkant onthult een cartoon met dwarsdoorsnede de langwerpige zeshoekige celvorm van lensvezels die in een honingraatpatroon zijn verpakt. Vezelcellen hebben twee brede zijden en vier korte zijden. Representatieve SEM-beelden langs de onderkant tonen de complexe membraaninterdigitaties tussen lensvezelcellen op verschillende diepten van de lens. Van rechts hebben nieuw gevormde lensvezels aan de rand van de lens kleine uitsteeksels langs de korte zijden en kogels langs de brede kant (rode vakken). Tijdens de rijping ontwikkelen lensvezels grote peddeldomeinen die worden versierd met kleine uitsteeksels langs de korte zijden (blauwe vakken). Rijpe vezelcellen bezitten grote peddeldomeinen die worden geïllustreerd door kleine uitsteeksels. Deze in elkaar grijpende domeinen zijn belangrijk voor de biomechanische eigenschappen van lenzen. Vezelcellen in de lenskern hebben minder kleine uitsteeksels langs hun korte zijden en hebben complexe tand-en-groef-interdigitaties (paarse vakken). De brede zijden van de cel vertonen een bolvormige membraanmorfologie. De cartoon is aangepast van22,32 en niet op schaal getekend. Schaalbalk = 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De lens groeit door schelpen van nieuwe vezelcellen toe te voegen die bovenop eerdere generaties vezels zijn gelegd24,25. Vezelcellen hebben een langwerpige, zeshoekige dwarsdoorsnedevorm met twee brede zijden en vier korte zijden. Deze cellen strekken zich uit van de voorste tot de achterste pool van de lens en afhankelijk van de soort kunnen de lensvezels enkele millimeters lang zijn. Om de structuur van deze langwerpige en dunne cellen te ondersteunen, creëren gespecialiseerde interdigitaties langs de brede en korte zijden in elkaar grijpende structuren om de vorm van de lens en de biomechanische eigenschappen te behouden. Veranderingen in de vorm van het celmembraan tijdens de differentiatie en rijping van vezelcellen zijn uitgebreid gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM) studies 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nieuw gevormde vezelcellen hebben ballen-en-sockets langs hun brede zijden met zeer kleine uitsteeksels langs hun korte zijden, terwijl volwassen vezels in elkaar grijpende uitsteeksels en peddels langs hun korte zijden hebben. Kernvezels vertonen tand-en-groef-interdigitaties en bolvormige membraanmorfologie. Er is weinig bekend over de eiwitten die nodig zijn voor deze complexe in elkaar grijpende membranen. Eerdere studies naar eiwitlokalisatie in vezelcellen waren gebaseerd op lensweefselsecties, die geen duidelijke visualisatie van de complexe celarchitectuur mogelijk maken.
Dit werk heeft een nieuwe methode gecreëerd en geperfectioneerd om enkele en bundels lensvezelcellen te fixeren om de complexe morfologie te behouden en om immunokleuring voor eiwitten op het celmembraan en in het cytoplasma mogelijk te maken. Deze methode behoudt getrouw de celmembraanarchitectuur, vergelijkbaar met gegevens uit EM-studies, en maakt kleuring mogelijk met primaire antilichamen voor specifieke eiwitten. We hebben eerder immunogekleurde corticale lensvezels die differentiatie en rijping ondergaan22,23. In dit protocol is er ook een nieuwe methode om vezelcellen uit de lenskern te kleuren. Dit protocol opent de deur naar het begrijpen van de mechanismen voor vorming en veranderingen in membraaninterdigitaties tijdens de rijping van vezelcellen en de verdichting van de lenskern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen zijn verzorgd op basis van een dierprotocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University Bloomington. De muizen die werden gebruikt om representatieve gegevens te genereren, waren controledieren (wildtype) met een C57BL6/J-achtergrond, vrouwelijk en 8-12 weken oud. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen voor dit experiment worden gebruikt, omdat het zeer onwaarschijnlijk is dat het geslacht van de muizen de uitkomst van het experiment beïnvloedt.
1. Lensdissectie en decapsulatie
- Euthanaseer muizen volgens de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" van de National Institutes of Health en de protocollen voor diergebruik die door de instelling zijn goedgekeurd.
OPMERKING: Voor de huidige studie werden muizen geëuthanaseerd door een overdosis CO2 gevolgd door cervicale dislocatie in overeenstemming met een goedgekeurd dierprotocol (Indiana University). - Ontbind de ogen van de muizen met behulp van een gebogen pincet door het weefsel rond de ogen met één kant van de pincet in te drukken om het oog uit de kas te verplaatsen. Sluit vervolgens de pincet onder het oog en til het op om het oog uit de oogkas te verwijderen. Breng de ogen over op verse 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een dissectiebak.
- Knip de oogzenuw met een ultrafijne schaar zo dicht mogelijk bij de oogbol door. Steek voorzichtig een recht pincet met fijne punt in de oogbol door de uitgang van de oogzenuw aan de achterkant van het oog.
- Steek voorzichtig een schaar in op dezelfde plaats als het pincet in stap 1.3 en begin met het knippen van een incisie van de achterkant naar de overgang tussen het hoornvlies en de sclera.
OPMERKING: Knaagdierlenzen bezetten ~30% van hun ogen. Onopzettelijke schade zal optreden als het pincet of de schaar te diep in het oog wordt gestoken. - Ga door met knippen langs de cornea-sclerale overgang totdat ten minste de helft van de overgang is gescheiden.
- Gebruik een pincet om voorzichtig op het hoornvlies te drukken, zodat de lens door de incisie kan ontsnappen die is gemaakt met stap 1.4 en 1.5.
- Verwijder voorzichtig grote stukken weefsel van de lens met een recht pincet met een fijne punt. Inspecteer de lens om het equatoriale gebied te vinden.
- Prik ondiep in de lens met een recht pincet met een fijne punt en verwijder vervolgens het lenskapsel. De massa lensvezelcellen blijft intact en de lensepitheliale monolaag blijft aan het lenskapsel vastzitten. Gooi het lenskapsel weg.
2. Lens enkele vezelcel kleuring
- Breng de celmassa van de lensvezel over naar een putplaat met 500 μL vers gemaakte 1% paraformaldehyde (PFA; in 1x PBS)-oplossing en incubeer de monsters een nacht bij 4 °C met zachte nootvorming (Figuur 2A).
OPMERKING: De volumes voor de gegeven oplossingen zijn geoptimaliseerd voor platen met 48 putjes. Als er een andere maat putplaat of buizen worden gebruikt, pas dan de volumes van de oplossingen dienovereenkomstig aan. Fixatie-, blokkerings- en wasoplossingen (1x PTX, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) werden gemaakt met 10x PBS en dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een eindconcentratie van 1x PBS. - Breng de lensvezelcellen over naar een schaal van 60 mm met 1% PFA. Gebruik een scherpe scalpel om de bal vezelcellen in tweeën te splijten langs de voorste-achterste as (Figuur 2B). Snijd de helften weer doormidden langs dezelfde as om kwarten te maken.
OPMERKING: De voorste-achterste as is gemakkelijk te herkennen aan de richting van de vezelcellen in de weefselmassa. - Gebruik een recht pincet om het kerngebied uit de kwartalen van de lensvezelcellen te verwijderen (Figuur 2C).
OPMERKING: Het gebied van de lenskern is stijf in knaagdierlenzen en het midden van de lens zal gemakkelijk scheiden van de zachtere corticale vezels. - Fixeer de kwartalen van het lenscortexgebied in 200 μL 1% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) met zacht schudden (300 tpm op een platenschudder).
- Was de weefselkwarten twee keer in 750 μL van 1x PBS gedurende 5 minuten elk met zacht schudden bij RT.
- Blokkeer de monsters met 200 μL blokkeringsoplossing (5% serum, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) gedurende 1 uur bij RT met zacht schudden.
OPMERKING: Voor de representatieve gegevens in dit protocol waren de monsters niet gekleurd met primaire of secundaire antilichamen. Na de blokkeringsstap werden de monsters geïncubeerd met tarwekiemagglutinine (WGA; 1:100) en phalloidine (1:100) (zie materiaaltabel) gedurende 3 uur bij RT met zacht schudden en bescherming tegen licht. Primaire antilichaamkleuring is aangetoond in eerdere publicaties22,23. - Incubeer met 100 μL primaire antilichaamoplossing gedurende een nacht bij 4 °C met zacht schudden.
OPMERKING: De antilichamen worden verdund in een blokkerende oplossing. In vergelijking met objectglaasjes met weefselcoupes zijn er meer cellen in dit type preparaat. De primaire antilichaamconcentraties moeten worden verhoogd om voldoende antilichamen te leveren om meer cellen te kleuren. Het wordt aanbevolen om de antilichaamconcentratie te verdubbelen ten opzichte van wat op weefselsecties wordt gebruikt. Hetzelfde geldt voor secundaire antilichamen. - Was de weefselkwarten drie keer met 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) gedurende 5 minuten elk bij RT met zacht schudden.
- Incubeer de vezelcellen met 100 μL secundaire antilichaam/kleurstofoplossing gedurende 3 uur bij RT met zacht schudden. Bescherm de monsters tijdens deze en volgende stappen tegen licht.
OPMERKING: WGA, phalloidine en andere fluorescerende kleurstoffen kunnen worden toegevoegd aan de secundaire antilichaamoplossing voor gelijktijdige etikettering van het celmembraan, cytoskelet of andere organellen, terwijl ook het primaire antilichaam wordt geëtiketteerd. - Was de vezelcellen vier keer met 1x PTX gedurende 5 minuten elk bij RT met zacht schudden.
- Voeg een druppel of 50 μL montagemedia toe aan een plus-geladen microscoopglaasje voordat u de weefselkwarten op het objectglaasje overbrengt.
- Gebruik een pincet om de vezelcellen voorzichtig van elkaar te scheiden en probeer overlapping van de celbundels te beperken.
- Breng voorzichtig een #1.5 dekglaasje aan op het monster in montagemedia. De bevestigingsmedia moeten zich uitstrekken tot aan de rand van het dekglaasje; Als dit niet gebeurt, voeg dan wat extra bevestigingsmedia toe aan de rand van het dekglaasje. Zuig overtollige montagemedia rond de rand van het dekglaasje weg en gebruik nagellak om de randen van het dekglaasje op het glaasje af te dichten.
OPMERKING: Elk type montagemedium dat is geformuleerd voor confocale microscopie kan voor deze experimenten worden gebruikt.
3. Kleuring van lenskern enkele vezelcellen
- Voltooi de ontleding die in sectie 1 wordt beschreven.
- Verwijder mechanisch de corticale vezels van de bal van de lensvezelcellen, waarbij u de lenskern verlaat, door de vezelcelmassa voorzichtig over te brengen naar natte, gehandschoende vingertoppen en de weefselmassa voorzichtig te rollen.
OPMERKING: Bij muizenlenzen is het rollen van de bal lensvezelcellen tussen gehandschoende vingertoppen een effectieve methode om de corticale vezelcellen uit de harde lenskernte verwijderen 28,30. Voor lenzen waarbij deze mechanische methode niet effectief is, kan zorgvuldige dissectie of een vortexmethode29 worden gebruikt om de corticale vezelcellen te verwijderen. - Breng de lenskern over in vers gemaakte 1% PFA-oplossing in een putplaat en incubeer een nacht bij 4 °C met zacht schudden.
- Breng het monster over naar een schaal van 60 mm met 1% PFA en gebruik een scherpe scalpel om de lenskern langs de voorste-achterste as te splitsen. Halveer de weefselmonsters opnieuw om kernkwarten te produceren.
- Volg het proces dat wordt beschreven in de stappen 2.4-2.13 voor immunokleuring en monstermontage.
Figuur 2: Grafische samenvatting van de bereiding en immunokleuring van lensvezelcellen . (A) Deze plaat met 48 putjes is per kolom kleurgecodeerd om een monsterplaatopstelling voor de beschreven methoden te demonstreren, waardoor monsters gemakkelijk kunnen worden overgebracht tussen de verschillende immunokleuringsstappen door voorzichtige behandeling met een pincet. Hoewel de representatieve gegevens voor dit protocol niet zijn geïncubeerd met een primair antilichaam, bevat het diagram een kolom voor de incubatie van primaire antilichamen en kunnen de wasputten opnieuw worden gebruikt na verwijdering van gebruikte wasbuffers door aspiratie. (B) Na fixatie van de celmassa van de lensvezel wordt het weefsel gesplitst langs de voorste-achterste as (rode stippellijnen) om de oorspronkelijke structuur van de cellen te behouden. Nadat de weefselmassa is gehalveerd, worden de monsters geroteerd en worden de helften in vieren verdeeld langs de voorste-achterste as (rode stippellijnen). (C) Het verwijderen van het lenskerngebied (in roze) is eenvoudig te doen met een pincet om het dichte centrale weefsel uit de corticale vezelcellen (in blauw) te graven. Cartoondiagrammen zijn gedeeltelijk gemaakt met behulp van BioRender.com en niet op schaal getekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lensvezelcellen worden bereid uit de lenscortex (differentiërende vezels en rijpe vezels) en de kern, en de cellen worden gekleurd met falloïdine voor F-actine en WGA voor het celmembraan. Een mengsel van bundels cellen of enkelvoudige lensvezels (Figuur 3) wordt waargenomen en in beeld gebracht. Vanuit de lenscortex worden twee soorten cellen gevonden (Figuur 3A). Differentiërende vezelcellen in de periferie van de lens zijn recht, met zeer kleine uitsteeksels langs hun korte zijden. Naarmate de cel differentieert, worden de vezelcellen golvend met kleine in elkaar grijpende uitsteeksels. Verder ontwikkelen vezelcellen tijdens het rijpingsproces grote peddels versierd met kleine in elkaar grijpende uitsteeksels. De lenskern is zeer compact en stijf in muizenlenzen en wordt geïsoleerd via mechanische verwijdering van de zachtere lenscortex vóór fixatie en kleuring van de nucleaire lensvezels. Vanuit de lenskern worden bundels lensvezels gevonden die een kleinere diameter hebben en fijne membraanstructuren hebben die niet gemakkelijk te zien zijn op een beeld met een lage vergroting.
In sterk vergrote 3D-reconstructies van lensvezelcellen uit verschillende delen van de lens (Figuur 3B), wordt gevonden dat F-actine en WGA sterk gecolokaliseerd zijn op het celmembraan in differentiërende en rijpe vezelcellen. F-actine is verrijkt in de in elkaar grijpende uitsteeksels langs het celmembraan in differentiërende en rijpe vezels (Figuur 3B, pijlpunten). Rijpe vezelcellen ontwikkelen grote in elkaar grijpende peddels (Figuur 3B, sterretjes). De WGA-kleuring is niet volledig gelokaliseerd met het F-actinesignaal, vooral in de volwassen vezelcel, wat suggereert dat het corticale actinenetwerk niet alle kleinere structuren langs het celmembraan ondersteunt. Onverwacht blijkt dat het F-actinenetwerk zich in het cytoplasma van kernvezelcellen bevindt. Terwijl het F-actinesignaal zich uitstrekt tot in de uitsteeksels (Figuur 3B, pijlen) langs het celmembraan van de kernvezel, is het actinenetwerk niet langer verrijkt in de buurt van het celmembraan of in de uitsteeksels. De morfologie van de kernvezelcel mist peddels, naast een afname van de organisatie en frequentie van uitsteeksels.
Figuur 3: Confocale beelden van bundels (lage vergroting) en enkelvoudige (sterk vergrote) beelden van vezelcellen uit verschillende delen van de lens. Cellen worden gekleurd met WGA (celmembranen, groen), phalloidine (F-actine, rood) en DAPI (kernen, blauw). (A) In deze preparaten worden vaak bundels lensvezelcellen gevonden uit verschillende regio's. In de corticale preparaten zijn er differentiërende en rijpe vezelcellen. Deze verschillende cellen hebben verschillende morfologieën, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. In de monsters van de lenskern worden zowel vezelcelbundels als gedissocieerde vezels gevonden. Schaalbalk = 50 μm. (B) Z-stacks door middel van enkelvoudige differentiërende, rijpe en nucleaire vezelcellen worden verzameld en 3D-rendering wordt gebruikt om de getoonde afbeeldingen te reconstrueren. De differentiërende en rijpe vezels hebben veel kleine uitsteeksels langs hun korte zijden (de pijlpunten markeren geselecteerde). Deze kleine uitsteeksels zijn verrijkt met F-actine. De rijpe vezel heeft ook grote in elkaar grijpende peddeldomeinen (sterretjes). De kernvezels hebben kleine membraanzakken en divots gekleurd door WGA en behouden een paar uitsteeksels langs hun korte zijden (pijlen). Verrassend genoeg is het F-actinenetwerk nu verdeeld in het celcytoplasma zonder verrijkte signalen op het celmembraan. Het F-actinenetwerk strekt zich uit tot kleine uitsteeksels. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Wanneer de vezelcellen worden onderzocht, is het belangrijk om de oriëntatie van de cellen te noteren om verwarring te voorkomen over welk type cel wordt waargenomen. Z-stacks worden door de cellen verzameld en vervolgens wordt 3D-reconstructie gebruikt om te kijken naar de orthogonale 2D-projecties in de XY-, XZ- en YZ-vlakken. Door de willekeurige oriëntatie van cellen in dit preparaat is het mogelijk om cellen te hebben die niet perfect plat op het glasplaatje liggen (Figuur 4). Alle cellen in deze representatieve afbeelding zijn volwassen lensvezels, maar elke cel heeft een drastisch ander uiterlijk in het XY-vlak. De cel pseudo-gekleurd in groen is breed naar boven georiënteerd met zichtbare peddels en uitsteeksels, terwijl de cel pseudo-gekleurd in roze ligt met de korte kant naar boven. Dit is gemakkelijker te visualiseren in het XZ-vlak, waarbij de loodrechte oriëntaties van de twee cellen in het XY-vlak worden weergegeven. Onderzoek van het YZ-vlak toont duidelijk de peddels van de volwassen vezel die roze is gekleurd vanuit het XY-vlak.
Figuur 4: Orthogonale 2D-projecties (XY-, XZ- en YZ-vlakken) van 3D-confocale z-stapels door een groep enkelvoudige rijpe lensvezelcellen gekleurd met phalloidine voor F-actine. Twee cellen zijn pseudo-gekleurd in roze of groen voor identificatie op elk vlak. In het XY-vlak ligt de roze cel met de korte kant naar boven, terwijl de groene cel plat ligt met de brede kant naar boven. In het XZ-vlak wordt waargenomen dat de roze cel in oriëntatie is gekanteld, terwijl de groene cel evenwijdig is aan het glasplaatje. In het YZ-vlak worden de peddels en uitsteeksels van de roze cellen waargenomen, wat bevestigt dat deze cel een volwassen vezelcel is. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aangezien vezels ongeveer 2-4 μm dikzijn 25,31, is het mogelijk om door het verzamelen van z-stacks het celoppervlak of een vlak door het cytoplasma te bekijken (Figuur 5). Dit werkt het beste op cellen die bijna evenwijdig zijn aan het dekglaasje, met de brede kant van de cel naar boven gericht. Het celoppervlak in deze volwassen vezelcel kan worden waargenomen door het WGA-signaal te observeren (Figuur 5A). Het XZ-vlak laat duidelijk zien dat dit XY-vlak zich langs de brede kant van de cel bevindt. Kleine WGA+ puncta langs het membraan suggereren een ruwe morfologie van het celoppervlak. De kleine uitsteeksels langs de korte zijde in opnamen met een lage belichting vertonen een sterk verrijkt F-actinesignaal. Bij hogere blootstelling, waarbij het F-actinesignaal in de uitsteeksels verzadigd is, wordt een fijn netvormig F-actinenetwerk waargenomen over het celmembraan (sterretjes). Wanneer een XY-vlak door het cytoplasma van de rijpe vezel wordt beschouwd (Figuur 5B), wordt WGA-kleuring voornamelijk langs het celmembraan waargenomen. Vergelijkbaar met wat wordt gezien aan het celoppervlak, is F-actine verrijkt in de uitsteeksels langs de korte zijden, met een netvormig cytoplasmatisch F-actinenetwerk dat zichtbaar is bij hogere blootstelling (sterretjes). Ons eerdere werk heeft de kleuring voor membraaneiwitten in XY-vlakken door het celcytoplasma22,23 aangetoond, maar met deze methode is het ook mogelijk om eiwitten langs het brede celoppervlak te lokaliseren.
Figuur 5: Orthogonale 2D-projecties (XY- en XZ-vlakken) van 3D-confocale z-stacks door een enkele rijpe vezelcel gekleurd met WGA (groen) en phalloidine (F-actine, rood). (A) Projecties van het celoppervlak langs de brede zijde tonen WGA langs het celmembraan, en de puncta van WGA suggereren dat het membraan niet helemaal glad is. F-actine is verrijkt in de uitsteeksels langs de korte zijden, en een high-exposure beeld van de F-actinekleuring onthult een netvormig netwerk langs het celmembraan (sterretjes). (B) Een ander vlak door het cytoplasma van dezelfde cel toont WGA langs het celmembraan, waardoor de cel wordt omkaderd. F-actine vormt een netvormig netwerk door het cytoplasma (sterretjes) en is sterk verrijkt in de uitsteeksels langs het celmembraan. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vervolgens worden beelden van lensvezels uit de scanning EM (SEM) en kleuringsexperimenten vergeleken. SEM-experimenten worden uitgevoerd zoals eerder beschreven29, en beelden worden achtereenvolgens genomen van het midden van het monster naar de periferie. Eerst worden differentiërende lensvezels met kleine uitsteeksels (Figuur 6, pijlen) langs hun korte zijden en een kogel (pijlpunten) langs hun brede zijden onderzocht. Net als bij het SEM-beeld (Figuur 6A), in een bundel differentiërende vezels die langs hun korte zijden zijn georiënteerd, zijn de kogel-en-kom-interdigitaties grote uitsteeksels en groeven die zich uitstrekken langs de brede kant van de cellen (Figuur 6B, pijlpunten). Een koker wordt gevonden (Figuur 6C, pijlpunten) wanneer de cel in de XY en XZ orthogonale 2D-projecties wordt bekeken in enkelvoudige differentiërende lensvezels. Kleine in elkaar grijpende uitsteeksels langs de korte zijden worden ook getrouw bewaard in deze gekleurde lensvezelcellen in vergelijking met die in het SEM-beeld (pijlen). Vervolgens wordt de morfologie van rijpe vezelcellen onderzocht (Figuur 7). In het SEM-beeld en de gekleurd cel zijn er kleine kuiltjes langs de brede kant van de cellen (Figuur 7A,B, pijlpunten). Vermoedelijk zijn dit de restanten van de kogel-en-kom-interdigitaties die tijdens het rijpingsproces krimpen. De grote peddels (sterretjes) versierd met kleine in elkaar grijpende uitsteeksels (pijlen) zijn vergelijkbaar tussen de cellen in SEM en de gekleurde rijpe vezel. De cellen in de SEM-afbeelding hebben ook duidelijke groeven waar een in elkaar grijpend uitsteeksel in het celmembraan is gedokt (Figuur 7C, pijlpunten). Deze groeven zijn ook te zien in deze gekleurde cellen en worden opgevuld door het WGA-signaal (Figuur 7D, pijlpunten). De groeven kunnen eruitzien als uitsteeksels die naar binnen gaan in de richting van het celcytoplasma in plaats van naar buiten te projecteren vanuit het celmembraan, en vaak is alleen WGA-kleuring zichtbaar in de groeven die zeer weinig of geen F-actinekleuringssignaal hebben.
Figuur 6: SEM en confocale microscoopbeelden van differentiërende vezelcellen uit de lenscortex. Vezelcellen voor confocale microscopie worden gekleurd met WGA (groen) en phalloidine (F-actine, rood). (A) SEM van een bundel differentiërende lensvezels vertoont kogel-en-kom interdigitaties (pijlpunten) langs de brede zijde van de cellen met kleine in elkaar grijpende uitsteeksels (pijlen) langs de korte zijden van de cellen. (B) Confocale beelden van een bundel differentiërende vezels die vanaf de korte zijden zijn afgebeeld, tonen grote kogel-en-kom-interdigitaties langs de brede zijden van de cellen (pijlpunten). (C) Orthogonale 2D-projecties (XY- en XZ-vlakken) door een enkele differentiërende lensvezel tonen een kogel-en-kom-interdigitatie (pijlpunten) langs de brede zijde en kleine in elkaar grijpende uitsteeksels langs de korte zijde (pijlen). Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: SEM en confocale microscoopbeelden van rijpe vezelcellen uit de lenscortex. Vezelcellen voor confocale microscopie worden gekleurd met WGA (groen) en phalloidine (F-actine, rood). (A) Het SEM-beeld heeft twee in elkaar grijpende rijpe vezels met peddels (sterretjes) versierd met kleine uitsteeksels (pijlen) langs de korte zijden van de cellen. Er zijn ook kleine inkepingen (pijlpunten) langs de brede kant van de cel. Dit zijn mogelijk de krimpende restanten van kogel-en-kom-uitsteeksels. Schaalbalk = 5 μm. (B) Orthogonale 2D-projecties (XY- en XZ-vlakken) door een enkele volwassen lensvezel hebben in elkaar grijpende grote peddels (sterretjes) en kleine uitsteeksels (pijlen) langs de korte zijden van de cellen. Langs de brede kant van de cel zijn kleine WGA+-ringen (pijlpunten) te zien, vergelijkbaar met de inkepingen in het SEM-beeld. Deze WGA+ structuren hebben geen F-actine kleuring. F-actine is meestal verrijkt bij het celmembraan in de kleine uitsteeksels en heeft een zwak netvormig kleuringspatroon in het cytoplasma. Schaalbalk = 5 μm. (C) SEM-afbeelding van de rijpe vezels met veel groeven in het celmembraan (pijlpunten), waar uitsteeksels van de naburige cellen rusten en in elkaar grijpen. Schaalbalk = 2 μm. (D) Een paar rijpe vezels die net zijn gescheiden en groeven (pijlpunten) vertonen die zijn gekleurd door WGA. De groeven hebben geen verrijking van F-actinekleuring en zien eruit als uitsteeksels die zich naar binnen uitstrekken in de richting van het cytosol, in plaats van zich naar buiten uit te strekken als een in elkaar grijpende structuur. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ten slotte worden de gekleurde nucleaire lensvezels vergeleken met beelden van SEM-preparaten. Deze nieuwe methode om nucleaire lensvezels te fixeren en te kleuren, behoudt getrouw de morfologie van nucleaire lensvezels in verschillende delen van de lens (Figuur 8). Kernvezelcellen hebben zeldzame en grotere in elkaar grijpende uitsteeksels langs hun korte zijden (pijlen). De buitenste nucleaire lensvezels hebben een ruwe celmembraantextuur, zoals te zien is in zowel SEM als de gekleurde celbeelden. Naarmate de cellen verder verdichten in de richting van het midden van de kern, verschijnen er tand-en-groef-interdigitaties langs het celmembraan (sterretjes) en hebben de binnenste kernvezels een bolvormige membraanmorfologie die kan worden gewaardeerd op het SEM-beeld en met WGA-kleuring. F-actine is niet langer verrijkt aan het celmembraan, maar vormt een netwerk dat het cytoplasma vult en zich zwak uitstrekt tot in de uitsteeksels.
Figuur 8: SEM en confocale microscoopbeelden van nucleaire lensvezelcellen. Vezelcellen voor confocale microscopie worden gekleurd met WGA (groen) en phalloidine (F-actine, rood). (A) SEM-beelden van kernvezels van de buitenste lagen naar het midden van de lens onthullen zeldzame en grotere in elkaar grijpende uitsteeksels aan de korte zijden van de cellen (pijlen). Het celmembraan is ruw in deze cellen, met tand-en-groef-interdigitaties (sterretjes) en bolvormige membraanmorfologie in de binnenste cellen. (B) 3D-reconstructies van confocale z-stacks door middel van enkele nucleaire lensvezels hebben vergelijkbare kenmerken als de SEM-beelden, waaronder uitsteeksels langs de korte zijden (pijlen), tand-en-groef-interdigitaties (sterretjes) en de ruwe membraanmorfologie die zichtbaar is bij WGA-kleuring. F-actine vormt een netwerk dat het celcytoplasma vult en zich zwak uitstrekt tot in de uitsteeksels. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol heeft de fixatie-, conserverings- en immunokleuringsmethoden gedemonstreerd die de 3D-membraanmorfologie van bundels of enkelvoudige lensvezelcellen van verschillende diepten in de lens getrouw behouden. De gekleurde lensvezels worden vergeleken met SEM-preparaten die al lang worden gebruikt om de morfologie van lensvezelcellen te bestuderen. De resultaten laten vergelijkbare membraanstructuren zien tussen beide preparaten. EM blijft de gouden standaard voor het bestuderen van celmorfologie, maar immunolabeling is een grotere uitdaging in SEM-monsters voor het lokaliseren van eiwitten33,34,35 en vereist een elektronenmicroscoop om te worden afgebeeld. Het voordeel van deze immunokleuringsmethode is dat meerdere doelen tegelijk kunnen worden gelabeld en dat beelden worden verzameld op een confocale microscoop.
Hoewel de methode de complexe celmorfologie behoudt, is SEM nog steeds nodig om interdigitaties tussen controle- en veranderde lensvezels als gevolg van genetische mutatie, veroudering, farmaceutische behandelingen, enz. te vergelijken. Het immunokleuringspreparaat creëert een mengsel van cellen uit de lenscortex of -kern die willekeurig over het objectglaasje worden verdeeld. Dus als de morfologie van de cellen is veranderd, kan het moeilijker zijn om de diepte te onderscheiden waarop cellen zich in de lens bevonden voordat ze werden gedissocieerd voor kleuring. In deze gevallen kan het nodig zijn om de lens verder te ontleden in interessegebieden na fixatie en kleuring van kleinere bundels lensvezels voor een hogere ruimtelijke nauwkeurigheid. De kleuringsresultaten moeten ook worden vergeleken met SEM-beelden om ervoor te zorgen dat de immunogekleurde vezels de morfologie van de veranderde cellen behouden.
Voor het eerst is aangetoond dat kernvezelcellen ook kunnen worden geconserveerd voor kleuring met behulp van deze nieuw gecreëerde methode. Het is belangrijk om de lenscortex te verwijderen voordat de kern wordt gefixeerd, omdat fixerende penetratie de lenskern niet bereikt bij het fixeren van de hele lens27. De methode van dit protocol om de lenskern te isoleren beschrijft de mechanische verwijdering van zachtere corticale lensvezels. Dit is mogelijk bij knaagdierlenzen door de zeer harde en compacte lenskern 28,30,36. Bij andere soorten is de lenskern zachter en kunnen andere methoden nodig zijn om die cellen te isoleren voor kleuring. Eerder werd een vortexmethode gebruikt om corticale vezelcellen te verwijderen uit een knock-out muislijn met een zachtere lenskern die niet betrouwbaar kon worden geïsoleerd door mechanische verwijdering29.
Hoewel we in deze representatieve gegevens geen primaire antilichaamkleuring hebben aangetoond, hebben we eerder hetzelfde type kleuring uitgevoerd met primaire antilichamen en geschikte secundaire antilichamen22,23. Onze ervaring is dat veel van de membraaneiwitten een punctaat signaal hebben, en daarom wordt het gebruik van WGA of F-actine in corticale vezels of WGA in kernvezels aanbevolen om het celmembraan duidelijk af te bakenen om celmembraaneiwitten beter te lokaliseren en elk stadium van celdifferentiatie en rijping te herkennen. De WGA- of F-actinekleuring moet zich in een zichtbaar kanaal (rood, groen of blauw) bevinden, zodat de waarnemer gemakkelijk de juiste cellen kan vinden voor beeldvorming met behulp van het oculair. Dit type membraankleuring kan ook helpen bij het identificeren van eventuele schade aan de cellen door het fixatie-, kleurings- en montageproces om mechanisch beschadigde cellen uit te sluiten. In dit en vorige werken22,23 worden mechanisch beschadigde cellen zelden waargenomen.
Deze methode vereist geduldig en systematisch onderzoek van cellen voor beeldvorming. De willekeurige mix van cellen kan op het eerste gezicht behoorlijk ontmoedigend zijn, maar cellen die in de optimale oriëntatie liggen, zijn meestal te vinden. Deze methode zou kunnen worden aangepast voor lensvezels die geïsoleerd zijn van andere soorten. In grotere lenzen kan het mogelijk zijn om zorgvuldige dissectie te gebruiken om de verschillende cellagen te scheiden vóór immunokleuring. Samenvattend heeft deze studie een robuuste en betrouwbare methode gecreëerd om bundels vezels of enkele vezelcellen te bewaren om hun complexe morfologie te bestuderen en eiwitten in 3D te lokaliseren in deze gespecialiseerde cellen. Dit unieke protocol voor het kleuren van nucleaire vezels opent een nieuw studiegebied naar de minder goed bestudeerde centrale vezels van de lens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidie R01 EY032056 (aan CC) van het National Eye Institute. De auteurs bedanken Dr. Theresa Fassel en Kimberly Vanderpool van de Scripps Research Core Microscopy Facility voor hun hulp bij de elektronenmicroscoopbeelden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
