Summary
该协议展示了一种简单易行的解剖方法，适用于用探照灯陷阱捕获的野生型迁徙雌性昆虫。该技术可以通过比较两种生殖组织（即野生型雌性昆虫的交配囊和卵巢发育）来显着阐明同一物种。
Abstract
迁徙性害虫对全世界的粮食生产和安全构成严重挑战。可以使用探照灯陷阱监测和捕获迁徙性害虫。迁徙性有害生物预测的最重要技术之一是识别迁徙物种。但是，在大多数情况下，仅凭外观很难获得信息。因此，利用通过对雌性生殖系统进行系统分析获得的知识，有助于了解探照灯陷阱捕获的野生型迁徙昆虫的卵巢交配囊和卵巢发育分级的综合解剖形态。为证明该方法的适用性，直接评估了 蛤蜊、蛤蜊、 苔 藓荠蛾和 苔 藓蛾的卵巢发育状况和卵粒发育阶段，并研究了卵巢交配囊 Agrotis ipsilon、Spaelotis valida、Helicoverpa armigera、Athetis lepigone、Mythimna separata、Spodoptera litura、Mamestra brassicae 和 Spodoptera exigua，探索他们的关系。本工作展示了预测野生型迁徙昆虫的具体解剖方法，比较了不同迁徙昆虫的独特生殖系统。然后，进一步研究了两个组织，即卵巢和交配囊。该方法有助于预测野生型雌性迁徙昆虫生殖系统的动态和结构发育。
Introduction
昆虫的迁徙在全球昆虫分布的种群动态中起着至关重要的作用，这些昆虫如棉铃虫、东方粘虫、草地贪夜蛾（芋头毛虫）、甜菜粘虫等昆虫的种群动态，这些昆虫在中国被报告为严重害虫 1,2,3,4.迁徙距离长、季节变化大、迁徙性强、生态因素等因素给这些害虫的预测、预报和防控带来了很大的困难5。需要对有害生物迁移进行监测，以揭示根据气候变化或周期促进迁移性有害生物的适应性和行为变化6.为了维持它们的生长、繁殖和生存，昆虫在进化过程中获得了连续的适应性;这一系列的适应性生活使生殖系统发生了许多变化，例如迁徙策略导致在漫长的迁徙过程中控制卵巢发育。
卵巢发育在迁徙性害虫中很常见，这会影响其种群的增长7.因此，卵巢发育长期以来一直是迁徙性害虫研究的热点。一系列研究导致了几个卵巢发育指标和分类策略。到目前为止，已经使用了几种方法来分析卵巢发育，例如，Loxostege sticticalis - 草甸蛾 - 卵巢发育，包括初始羽化阶段、早期产卵期、产卵期和产卵期结束 8.一些研究人员根据迁徙性鳞翅目害虫的蛋黄颜色发育来划分卵巢水平，例如甜菜粘虫 S. exigua、Pseudaletia unipuncta - 真正的粘虫和 Cnaphalocrocis medinalis（水稻叶文件夹等）9,10,11,12.以往研究将棉铃虫、水稻卷叶虫等害虫的卵巢发育水平分为卵黄沉积期、卵粒成熟期、成熟等待期、卵源高峰期和产卵期结束13,14。欧洲玉米螟的卵巢发育分为6个发育阶段：卵黄沉积期、卵成熟期、卵前处置期、产卵高峰期和末产卵期15。
此外，同一属昆虫的发育阶段不同，草地贪夜蛾（草地贪夜蛾）的卵巢发育水平分为四个层次：卵黄沉积期、成熟等待分娩期、卵阳性高峰期和产卵期结束16。另一方面，甜菜蛾（甜菜蛾）的卵巢发育有五个层次：透明、卵生、卵成熟、产卵和晚期产卵水平17。
以前的研究只能使用卵黄的颜色成熟度、产卵和卵子发育来对单个卵巢发育水平到多个卵巢发育水平进行分类，但不能根据生殖系统的解剖结构进行分类。基于形态发生解剖学的卵巢发育是一个研究较少的领域。本文采用解剖方法，利用两种卵巢组织类型预测种群中的迁徙雌性，基于卵巢发育阶段和交配囊的解剖形态发生，阐述其生殖动力学，为区分迁徙野生型雌性提供直接证据。
一些研究发现，洄游 夜蛾科 昆虫物种经常被探照灯捕获18。大多数洄游 夜蛾科 昆虫的子房在迁徙初期处于发育的早期阶段，卵巢水平随着迁徙的进行而增加。本研究描述了卵巢发育等级的解剖方法，研究了探照灯捕获的不同雌性种群害虫的两种生殖组织。该方法不仅推进了对迁徙动态的研究，而且为昆虫分类、昆虫生理学研究、害虫预测和雌性害虫物种的预测提供了便利。
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Protocol
注意：在诱捕野生型迁徙昆虫之前要注意安全措施，建议穿戴安全装备（手套、长袖衬衫和护目镜）。此外，不使用时请关闭疏水阀，以免出现其他安全隐患和灯过热。解剖前遵循安全规程很重要，例如戴手套、护目镜和实验室外套，以防止接触体液和化学物质。
1. 迁徙昆虫的诱捕
- 通过使用探照灯诱捕昆虫来开始此协议。在本协议中，测试昆虫来源为中国山东省济南市济阳区（北纬36.977088°，东经116.982747°）。
- 使用探照灯灯的主体，即不生锈的钢，盒子，这是一个矩形的主体，GT75型卤素大灯，功率为1000W，将前照灯放在中间作为光源。
- 在灯的内部和底部放置一个漏斗状的昆虫收集通道，放置一个直径为5厘米的昆虫收集箱，然后放置一个60阶的昆虫收集网袋（0.5 m x 0.5 m），用于收集被光困住的昆虫。已知的光投射距离地面约500 m。
- 该协议强调野生型雌性的迁徙动态和卵巢发育;因此，收集不同种类的昆虫（这里的收集是在 2021 年至 2022 年期间的 4 月至 8 月进行的）。避免收集小型和受伤的昆虫，选择类似大小的大型害虫进行此实验。
2.昆虫的制备
- 将所有收集的昆虫从网袋（0.5 m）转移到网笼（30 cm x 30 cm），然后提供含有10%蜂蜜水灭菌溶液的培养皿（喂食可选）。将笼子置于27±2°C，65%±12%相对湿度下，并在黑暗中保持8-12小时。
- 选择同一天飞入笼子内的野生型雌性，小心地将它们转移到单独的小瓶管中，并用棉盖关闭每个管子。避免直接处理，否则可能会因压力过大而损坏或伤害害虫。
注意：所有野生型雌性均在夜间捕获，并在白天进行解剖。因此，每个实验都在一天内进行。
3.昆虫麻痹法的制备方法（图1）
- 将选定的雌性害虫单独放入中间的苍蝇瓶管中，并通过握住吹枪针使用CO2 气体麻醉雌性害虫，以引起轻度麻痹。要确认害虫是否瘫痪，请使用软刷轻轻推或触摸害虫。对软刺激和不动没有反应表明瘫痪成功。
注意：低温（-20°C）也可用作麻痹昆虫的替代技术。
4. 昆虫解剖
- 将新鲜瘫痪的雌性放入含有无水乙醇（10mL）的解剖培养皿中。为避免解剖过程中鳞片毛和翅膀粉末的影响，用无水酒精浸入活的或瘫痪的昆虫中，并用清水冲洗。
- 使用两对镊子将背翅与胸部和腹部身体的交界处分开。
- 将腹部转移到新的一次性培养皿中，装有适量的水（2-5mm深），并使用解剖镊子沿着背腹线从尖嘴到尾巴轻轻剥离腹部外骨骼。在另一侧重复相同的步骤，然后将其放入清水中以分散完整的组织。
- 用镊子小心地剥离表皮脂肪组织，轻轻拉动并释放卵巢。
- 使用解剖镊轻轻去除卵巢周围的脂肪颗粒和其他器官。一般害虫卵巢多在腹部两侧向内折叠，在展开卵巢的同时尝试在液体环境中操作，从中间慢慢剥离交配囊，挑出附着在卵巢管上的脂肪颗粒。
- 从垂直的后端轻轻抓住卵巢和交配囊，然后小心地向下展开。为避免在展开过程中损坏，将卵巢转移到装有水的新培养皿或干净的培养皿中。握住卵巢尖端，向内展开卵巢;小心执行此步骤以避免卵泡受损。
5. 分析卵巢组织解剖学数据
- 在此步骤中，根据卵的颜色和大小评估每种昆虫的卵发育，以判断其成熟度。然后，根据卵子发育情况判断卵巢等级。
注意：卵巢发育水平的划分主要分为卵子前或卵黄沉淀水平的卵发育。为了更清楚起见，昆虫的卵粒发育进一步分为几个阶段，如卵黄发生阶段、卵黄成熟阶段和卵黄死亡阶段。蛋粒的成熟度取决于鸡蛋的饱满度、颜色和大小来判断其成熟度。 - 解剖后，确保将雌配囊组织与完整的卵巢分开，并观察形态以区分物种，因为大多数交配囊的解剖结构因物种而异。因此，使用交配囊来区分物种。
- 在此步骤中，评估卵巢解剖结构，并分析卵巢发育分级。将卵巢组织分为五个等级（1级至5级）。
- 寻找以下组织的变化和结构：一级（1）是发育的早期阶段（乳白色透明），腹部饱满，柔软，脂肪体蓬松，颜色浅，难以剥离。二级（2）是卵黄沉积阶段，在观察更长和更厚的卵巢管后，如果需要，可以单独对卵巢进行分级。三年级（3）的脂肪体较少，只有少数颗粒附着在子房上。四年级（4）看起来弹性较差，容易折断，子宫管中间可能存在一些卵子。五年级 （5） 很容易识别，身体脂肪较少或没有脂肪，卵巢萎缩和脆弱。
- 根据实验需要使用数码相机拍摄图像。
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Representative Results
卵子的发育
上述方案用于分析卵巢中卵子的发育。为此，首先将卵分为四个阶段，以区分所有物种（如棉铃虫、粘虫、芋头毛虫和甜菜蛾）的卵发育早期和成熟阶段。在这里，观察到羽化的早期阶段（乳白色透明阶段）。 图2A 显示卵巢尚未开始发育，卵巢导管呈丝状，弹性好。由于鸡蛋的美味，形成的蛋粒在日光下无法看到，并且通过拉伸卵巢管可以看到透光的乳白色斑点。
卵巢发育（卵黄沉积阶段）包含大卵，略显不成熟，呈乳白色，卵子紧密接触 （图2B）。在 图2C中可以观察到成熟的待交付（成熟阶段），卵呈珠状，完全成熟，呈亮黄色。 图2D 显示了卵黄灭绝期（产卵期），卵巢管的脆弱性。大部分活性蛋粒被释放出来，只有少数或没有蛋粒，可能存在不活跃的蛋。
交配囊形态的比较
在交配囊的基底上共比较了8种野生型雌性物种。每个物种的昆虫数量超过100种。选择最具代表性的交配囊作为展示示例（图3）。Helicoverpa armigera的交配囊是具有内腔的柱状右螺旋（图3A）。Mythimna separata交配囊呈G形/鱼钩状，内部有深褐色条带（图3B）。Agrotis ipsilon 交配囊是线性的，背面有大线圈和外囊肿（图 3C）。
Spaelotis valida（图3D）有一个交配囊，在扩大后略薄且呈J形;它看起来像一条腿，颜色略带褐色。草地贪夜蛾物种呈白色半透明哑铃形囊，中间有一个气泡囊，远端为乳白色（图3E）。草地贪夜蛾交配囊在嘴端呈红色，上部可观察到乳白色透明，隐约可见内部囊腔（图3F）。Pseudoptera lepigone 交配囊是小卷曲的，外囊肿看起来像一朵闭合的花，从上到下呈白色和棕色（图 3G），而 Mamestra brassicae 有一个双卷曲囊，外囊呈橄榄色（图 3H）。
迁徙野生型雌性卵巢发育分级
在卵巢发育分级中，对棉铃虫、粘虫、芋头毛虫和甜菜蛾 4 种野生型雌性物种的 1 级至 5 级进行了评估。棉铃虫（H. armigera）卵巢分级分析结果 （图4） 显示，卵巢导管透明且有弹性，1级有细微可见的卵母细胞 （图4A）。卵巢导管是透明的，卵子是嫩黄色的，2级透明包裹 （图4B）。在3级 （图4C）时，不存在大的脂肪体，只有少数脂肪颗粒附着在卵巢导管上。卵巢导管是产卵器附近最长、最厚的，成熟区、生长区和原卵区划分清晰，卵巢导管呈黄色，呈全念珠状。4 级和 5 级 （图 4D，E） 显示卵巢中的卵簇和较少的卵子呈淡黄色和绿色。
同样，在粘虫（M. separata）中发现了所有五个等级的观察结果，如 图5所示。脂肪体是由多个脂肪颗粒组成的絮状质地，蓬松，颜色浅，乳白色，带有细腻的可见卵母细胞 （图5A）。在2级时，卵巢管结构是黄色的，充满了珠状的卵子 （图5B）。虽然 3 级和 4 级 （图 5C，D） 完全成熟，卵巢导管是白色和奶油色的，卵粒是白色的，外面有透明的卷曲包裹，但卵子很饱满但很拥挤。5 级显示 （图 5E） 颜色从黄色下降到深棕色;它强调卵巢发育的最后阶段。
芋头毛虫（S. litura）和甜菜蛾（S. exigua）的卵巢分级也使用与图6和图7所示相同的卵巢分级水平进行观察。与甜菜蛾的子房（图7A，B）相比，芋头毛虫的1级和2级的子房（图6A，B）是薄的，扩大的，粉红色的，白色的，短的，蓬松的和宽的。两个卵巢的卵巢导管形态发生程度相似，卵母细胞透明、有弹性、可见。两个物种的3级和4级结果显示，卵巢处于同一发育阶段，它们呈深黄色，卵子饱满（图6C，D）。另一方面，从天蓝色到浅绿色可以看到相同的颜色变化（图7C，D）; 这种颜色的变化表明卵巢发育的成熟阶段。用输卵管中的褐色和少量卵簇评估晚期产卵（图6E）。图7E显示了一个卵巢，输卵管很薄，卵子簇蓬松，描绘了卵子的5级卵巢发育，卵巢逐渐变大，颜色变深，呈白蓝色。
图 1：用于实验的工具。 从迁徙昆虫中解剖卵巢和交配囊所需的基本工具。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：卵子发育阶段。 野生型迁徙昆虫（棉铃虫、粘虫、芋头毛虫、甜菜蛾）的卵发育阶段， （A） 乳白色透明阶段， （B） 卵黄沉积阶段， （C） 成熟阶段， （D） 产卵末期或卵黄灭绝期。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：不同昆虫的交配囊。（A） Helicoverpa armigera的交配囊;（B） Mythimna的交配囊分离;（C） Agrotis ipsilon的交配囊;（D）Spaelotis valida的交配囊;（E） 草地贪夜蛾的交配囊;（F） 草地贪夜蛾的交配囊;（G） Athetis lepigone的交配囊; （H） 芸苔科的交配囊。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4： Helicoverpa armigera的卵巢发育分级。（答） 1级（乳白色透明期）; （B） 2级代表卵巢发育期（卵黄沉积期）; （三） 三级为成熟期; （D） 4级表示产卵等级; （E） 5 级代表晚期产卵。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：Mythimna separata的卵巢发育分级。 （A） 1级（乳白色透明期）;（B） 2级代表卵巢发育期（卵黄沉积期）;（三）三级为成熟期;（D） 4级表示产卵水平;（E） 5 级表示产卵较晚。请点击这里查看此图的较大版本.
图6： 草地贪夜蛾的卵巢发育分级。 （A） 1级（乳白色透明期）; （B） 2级代表卵巢发育期（卵黄沉积期）; （三） 三级为成熟期; （D） 4级表示产卵水平; （E） 5 级表示产卵较晚。 请点击这里查看此图的较大版本.
图7：草地贪夜蛾的卵巢发育分级。 （A） 1级（乳白色透明期）;（B） 2级代表卵巢发育期（卵黄沉积期）; （三）三级为成熟期;（D） 4级表示产卵水平;（E） 5 级表示产卵较晚。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
卵巢分析方法通常用于植物保护，以阐明昆虫飞行和种群的运动，以预测19,20,21，并详细阐述昆虫的生理变化。人们注意到，棉铃虫、粘虫、芋头毛虫、甜菜蛾等常见农业害虫独特的迁徙和快速扩散能力，使其他地区难以预测。一些研究认为 Athetis lepigone 是迁徙性害虫22,23，但这种害虫的迁徙动态和预测难以捉摸。最近，又引进了1000 W探照灯监测迁徙性害虫的诱光方法18,24，对迁徙性害虫监测有很好的应用效果。也有人推测，光诱捕方法不足以区分迁徙昆虫。本研究在迁徙高峰期，探照灯诱捕器捕获的成虫数量主要为迁徙性害虫，而区域个体数量可忽略不计。这突出表明，迁徙物种的出现期非常相似25.为了避免区域个体，重要的是要考虑迁徙高峰期，以捕获大量的迁徙个体。因此，用探照灯识别迁徙昆虫和卵巢分级都是基本方面。然而，只有少数方法可以识别迁徙昆虫的卵巢解剖结构13,26,27,28,29。这里介绍的可行方法是创新工作，它建立了使用卵巢组织、交配囊和卵巢分级来区分不同的发育阶段，并试图比以前的研究更详细地讨论卵巢组织的形态发生特性11,21,30;特别是关于最危险的野生雌性害虫，例如使用探照灯捕获的 H. armigera31、M. separata32 和 S. litura33。
以前的大多数研究都使用区分方法来评估迁徙昆虫的识别，对卵巢发育进行分类。这些研究的重点是蛋黄的颜色成熟度、产卵、出生发育、交配频率等22,30,34,35。本研究中使用的方法引入了基于两个卵巢组织的双向比较证据。对于棉铃虫、粘虫、芋头毛虫、甜菜蛾、Agrotis ipsilon、Spaelotis valida、Athetis lepigone 和 Mamestra brassicae，研究了交配囊。直接评估卵粒发育阶段 Helicoverpa armigera、Mythimna separata、Spodoptera litura 和 Spodoptera exigua 的卵巢解剖学。根据昆虫雌性成虫卵巢解剖学，卵的发育因物种而异16,17,36,37。因此，通过分析卵巢发育等级和交配囊，研究迁徙昆虫两个层次的卵巢形态是有用的。
一般来说，长期或储存不当，如湿度、温度和食物来源的波动，使用探照灯捕获的昆虫可能会影响体重、卵子健康和卵巢大小5,38,39,40,41,42。这导致后期昆虫分选和解剖困难，导致数据不完整。为了尽量减少这些错误，短期和适当的存储是必要的。此外，在应用该协议后，进一步选择了相似大小的雌性。这种对女性的选择和收集节省了时间，在本研究中取得了快速而显着的结果。该方法展示了自然环境中野生型成年迁徙昆虫的解剖及其卵巢分级。为了有效执行该协议，应考虑一些关键步骤。例如，从自然环境中选择昆虫是防止卵巢空虚和卵子不育的关键步骤;具有完整组织器官的活昆虫是可取的，避免死亡，虚弱，破碎或缩小的腹腔昆虫。
因此，卵巢组织的解剖可以通过比较卵巢梯度来估计，例如在棉铃虫（H. armigera）卵巢分级（图4）中，卵子从卵巢中的乳白色和透明卵卵体成熟到深黄色。散在的卵产（图5）发生在粘虫中，其中卵巢从乳白色透明的卵体成熟，呈乳白色或淡黄色。芋头毛虫从乳白色透明的卵细胞呈粉红色和柔软，并进一步成熟为棕色或黄色（图6）。这项工作的继续同时决定了不同物种的卵巢解剖结构。这种做法将有助于在植物保护领域研究昆虫的运动，并可以指导害虫预测。
目前，这项研究存在一些局限性。该方法的应用取决于对蛋粒和卵巢发育特性的详细分析。未来一个关键的挑战是进一步推进和改进基于实地的分析，以评估生态系统中雌性害虫的迁徙动态。因此，有必要结合现场数据进行统计分析，因为卵巢分级受环境因素的影响，例如迁徙昆虫的年度量化、温度、湿度、场地风向和食物等。假设所有物种都具有相同的卵巢分级和交配荚膜水平。尽管如此，它仍然需要用相对相似的物种进行验证，因为自然界中昆虫的可用性各不相同，并可能导致缺乏预测。因此，未来仍有必要验证使用两个卵巢组织解剖相似物种的高海拔迁徙雌性。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
本研究得到了重大科技创新项目（2020CXGC010802）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Canon ( China ) co., LTD | EOS 800D | |
| Dropper | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | ||
| Ethanol absolute (99.7%) | Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD | ||
| Forceps | Vetus Tools co., LTD | ST-14 | |
| GT75 type halogen headlamp (1000 W) | Shanghai Yadeng Industry co., LTD | ||
| Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua | Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China | ||
| Measuring cylinder, beaker, flask | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | ||
| Net bag | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | 0.5 m | |
| Net cages | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | 30 cm x 30 cm | |
| Petri dishes | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | 60 mm diameter |
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