Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

דיסקציה ודירוג התפתחות השחלות בנקבות חרקים מסוג בר

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65644
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences

Summary

הפרוטוקול מדגים שיטת דיסקציה פשוטה וקלה, המתאימה לנקבות חרקים נודדות מסוג בר שנלכדו במלכודות זרקור. טכניקה זו יכולה להבהיר באופן משמעותי את אותו מין על ידי השוואת שתי רקמות הרבייה, כלומר שק ההזדווגות והתפתחות השחלות של חרקים נקבות מסוג בר.

Abstract

מזיקים חרקים נודדים מציבים אתגרים רציניים לייצור מזון וביטחון בכל רחבי העולם. ניתן לנטר וללכוד את המזיקים הנודדים באמצעות מלכודות זרקורים. אחת הטכניקות החשובות ביותר לחיזוי מזיקים נודדים היא זיהוי המינים הנודדים. עם זאת, ברוב המקרים, קשה לקבל את המידע רק על ידי המראה. לכן, שימוש בידע שנרכש על ידי ניתוח שיטתי של מערכת הרבייה הנשית יכול לעזור להבין את המורפולוגיה האנטומית המשולבת של שק ההזדווגות השחלתי ודירוג התפתחותי של שחלות של חרקים נודדים מסוג בר שנלכדו במלכודות זרקור. כדי להדגים את הישימות של שיטה זו, מצב התפתחות השחלות ושלבי התפתחות גרגרי הביציות הוערכו ישירות ב- Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura ו - Spodoptera exigua עבור האנטומיה השחלתית, ושקי ההזדווגות השחלתיים נחקרו ב- Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae ו - Spodoptera exiguaלחקור את מערכות היחסים שלהם., עבודה זו מציגה את שיטת הדיסקציה הספציפית לחיזוי חרקים נודדים מסוג בר, תוך השוואת מערכת הרבייה הייחודית של חרקים נודדים שונים. לאחר מכן, שתי הרקמות, כלומר השחלה ושקי ההזדווגות, נחקרו עוד יותר. שיטה זו מסייעת לחזות את הדינמיקה ואת ההתפתחות המבנית של מערכות הרבייה אצל נקבות חרקים נודדים מסוג בר.

Introduction

נדידת חרקים ממלאת תפקיד חיוני בדינמיקת האוכלוסייה של תפוצת חרקים עולמית לחרקים כמו Helicoverpa armigera - תולעת הכותנה, Mythimna נפרדת - תולעת הצבא המזרחית, Spodoptera litura - זחל הטארו, Spodoptera exigua - תולעת צבא הסלק, שדווחו כמזיקים חמורים בסין 1,2,3,4 . מרחקי הנסיעה הארוכים, התנועות העונתיות, ריבוי גבוה של מזיקים נודדים וגורמים אקולוגיים הביאו לקשיים רבים בניבוי, חיזוי והדברה של מזיקים אלה5. ניטור נדידת מזיקים נדרש כדי לחשוף את יכולת ההסתגלות והשינויים ההתנהגותיים המאפשרים מזיקים נודדים בהתאם לשינויי אקלים או מחזורים6. כדי לשמור על גדילתם, התרבותם והישרדותם, חרקים רכשו יכולת הסתגלות רציפה במהלך האבולוציה; סדרה זו של חיים אדפטיביים יצרה שינויים רבים במערכת הרבייה, כגון אסטרטגיית הגירה המובילה לשליטה על התפתחות השחלות בתהליך הנדידה הארוך.

התפתחות השחלות נפוצה אצל מזיקים נודדים, מה שמשפיע על גדילת האוכלוסייה שלהם7. לכן, התפתחות השחלות היא נושא חם של מחקר מזיקים נודדים במשך זמן רב. סדרה של מחקרים הובילה למספר אינדיקטורים להתפתחות השחלות ואסטרטגיות סיווג. עד כה, מספר שיטות שימשו לניתוח התפתחות השחלות, למשל, Loxostege sticalis - עש האחו - התפתחות השחלה הכוללת את שלב הנוצות הראשוני, תקופת ההשרצה המוקדמת, תקופת ההשרצה וסוף האוביפוזיציה8. יש חוקרים המחלקים את רמות השחלות על בסיס התפתחות צבע החלמון במזיקים לפידופטרניים נודדים, כגון S. exigua - תולעת צבא הסלק, Pseudaletia unipuncta - תולעת הצבא האמיתית, ו- Cnaphalocrocis medinalis- תיקיית עלי האורז וכו '.9,10,11,12 . במחקרים קודמים חולקו רמות ההתפתחות השחלתית של מזיקים, כגון תולעת צמר גפן ורולר עלי אורז, לחמישה שלבים: שלב שקיעת החלמון, שלב הבשלת גרגרי הביצה, ההמתנה הבוגרת ללידה, תקופת שיא ההשרצה ושלב סיום ההשרצה13,14. ההתפתחות השחלתית של בורר התירס האירופי חולקה לשישה שלבים התפתחותיים: שלב שקיעת החלמון, הבשלת הביציות, נטיית טרום ביציות, שלב שיא ההשרצה ושלב ההשרצה הסופית15.

יתר על כן, לחרקים מאותו סוג יש שלבי התפתחות שונים, כגון רמות התפתחות השחלות של Spodoptera frugiperda - תולעת צבא הסתיו - מתחלקות לארבע רמות: שלב שקיעת החלמון, המתנה בוגרת ללידה, שיא אובי-פוזיטיביות, וסיום שלב ההשרצה16. מצד שני, להתפתחות השחלות ב- Spodoptera exigua - עש הסלק - יש חמש רמות: שקוף, ויטלוגנזה, הבשלת ביציות, שחרור ביצים והטלת ביצים מאוחרת17.

מחקרים קודמים יכולים לסווג את ההתפתחות רק מרמות התפתחות שחלות בודדות למרובות באמצעות בשלות צבע של חלמון, ביצית והתפתחות ביצית, אך לא ניתן לבצע סיווג על סמך אנטומיה של מערכת הרבייה. התפתחות שחלה המבוססת על אנטומיה מורפוגנזה היא תחום פחות נחקר. כאן, שיטת הדיסקציה נועדה לחזות נקבות נודדות באוכלוסייה באמצעות שני סוגי רקמת שחלה, כדי לפרט את דינמיקת הרבייה שלהן בהתבסס על המורפוגנזה האנטומית של שלב התפתחות השחלות ושק ההזדווגות - ולספק ראיות ישירות להבחנה בין נקבות בר נודדות.

כמה מחקרים מצאו כי, מיני חרקים נודדים Noctuidae נלכדו לעתים קרובות על ידי זרקורים18. השחלה של רוב מיני החרקים הנודדים Noctuidae נמצאת בשלבי התפתחות מוקדמים בשלב הראשוני של הנדידה ורמת השחלות עולה עם התקדמות הנדידה. במחקר זה מתוארת שיטת הדיסקציה לציוני התפתחות השחלות, כדי לחקור את שתי רקמות הרבייה של מזיקים שונים באוכלוסיית הנשים, שנלכדו באור חיפוש. שיטה זו לא רק מקדמת את המחקר להבנת דינמיקת הנדידה, אלא גם מתקנים בסיווג חרקים, מחקר פיזיולוגיה של חרקים, חיזוי מזיקים וחיזוי מיני מזיקים נקבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: שימו לב למדידות בטיחות לפני לכידת חרקים נודדים מסוג בר, מומלץ ללבוש ציוד בטיחות (כפפות, חולצות עם שרוולים ארוכים ומשקפי מגן). כמו כן, כבו את המלכודת כאשר אינה בשימוש כדי למנוע סכנות בטיחות אחרות וחימום יתר של האור. חשוב לעקוב אחר פרוטוקולי בטיחות לפני נתיחה, כגון לבישת כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה כדי למנוע חשיפה לנוזלי גוף וכימיקלים.

1. לכידת חרקים נודדים

  1. התחל פרוטוקול זה על ידי לכידת חרקים באמצעות מנורת הזרקור. בפרוטוקול זה, מקור חרק הבדיקה הוא מחוז ג'יאנג, העיר ג'ינאן, מחוז שאנדונג, סין (36.977088° N, 116.982747° E).
  2. השתמש בגוף הראשי של מנורת הזרקור, העשויה פלדה לא חלודה, בתיבה, שהיא גוף מלבני, ובפנס הלוגן מסוג GT75, בהספק של 1000 W. מקם את הפנס הקדמי באמצע כמקור האור.
  3. הניחו תעלת איסוף חרקים בצורת משפך בתוך האור ובתחתיתו, הניחו קופסה לאיסוף חרקים בקוטר של 5 ס"מ, ואחריה שקית רשת לאיסוף חרקים בת 60 מסדר (0.5 מ' על 0.5 מ'), המשמשת לאיסוף חרקים לכודים באור. הקרנת האור הידועה היא בגובה של כ-500 מ' מעל פני הקרקע.
  4. פרוטוקול זה מדגיש את דינמיקת הנדידה של נקבות פראיות והתפתחות השחלות; לכן, לאסוף מינים שונים של חרקים (כאן האיסוף נעשה מאפריל עד אוגוסט, במהלך 2021 עד 2022). הימנעו מאיסוף חרקים קטנים ופצועים, בחרו מזיקים גדולים בגודל דומה לניסוי זה.

2. הכנת חרקים

  1. מעבירים את כל החרקים שנאספו משקית הרשת (0.5 מ') לכלוב הרשת (30X30 ס"מ), ולאחר מכן מספקים צלחת פטרי המכילה תמיסה מעוקרת של 10% מי דבש (האכלה היא אופציונלית). מניחים את הכלוב על 27 ± 2 מעלות צלזיוס, 65% ± 12% לחות יחסית, ולשמור בחושך במשך 8-12 שעות.
  2. בחרו נקבות בר שעפו בתוך הכלוב באותו היום, העבירו אותן בזהירות לצינורות הבקבוקון הבודדים, וסגרו כל צינור עם מכסה כותנה. הימנעו מטיפול ישיר, שעלול לפגוע או לפצוע את המזיק עקב לחץ מוגזם.
    הערה: כל נקבות הבר נלכדו בשעות הלילה והנתיחה בוצעה בשעות היום. לפיכך, כל ניסוי בוצע בתוך יום.

3. הכנה לשיטה לשיתוק חרקים (איור 1)

  1. הכניסו נקבת מזיק נבחרת בנפרד לתוך צינור בקבוקון זבוב באמצע והרדימו את הנקבה באמצעות גזCO2 על ידי החזקת מחט אקדח נשיפה כדי לגרום לשיתוק קל. כדי לוודא אם המזיק משותק או לא, דחפו בעדינות או געו במזיק באמצעות מברשת רכה. אין תגובה לגירויים רכים וחוסר תנועה המעידה על שיתוק מוצלח.
    הערה: טמפרטורה נמוכה (-20 °C) יכולה לשמש גם כטכניקה חלופית לשיתוק חרקים.

4. נתיחת חרקים

  1. הכניסו נקבה משותקת טרייה לצלחת פטרי מנותחת המכילה אתנול מוחלט (10 מ"ל). כדי למנוע את ההשפעה של שערות קשקשים אבקת כנפיים במהלך דיסקציה, לחדור את החרק החי או משותק עם אלכוהול מוחלט לשטוף במים נקיים.
  2. מפרידים את הכנפיים הגביות מצומת גוף החזה והבטן, באמצעות שני זוגות מלקחיים.
  3. מעבירים את הבטן לצלחת פטרי חד פעמית חדשה, המכילה כמות מתאימה של מים (2-5 מ"מ עומק), ומקלפים בעדינות את השלד החיצוני של הבטן לאורך קו הגחון הגבי מהפה המחודד אל הזנב, באמצעות מלקחיים מנתחים. חזור על אותם צעדים בצד השני, ולאחר מכן לשים אותו במים נקיים כדי לפזר את הרקמות שלמות.
  4. בזהירות לקלף את רקמות שומן האפידרמיס באמצעות מלקחיים, בעדינות למשוך ולשחרר את השחלות.
  5. השתמש במלקחיים מנתחים כדי להסיר בעדינות חלקיקי שומן ואיברים אחרים סביב השחלות. בדרך כלל, השחלות המזיקות מקופלות לרוב פנימה משני צידי הבטן, מנסות לפעול בסביבה נוזלית תוך כדי פתיחת השחלות, ולאט לאט מקלפות את שק ההזדווגות מהאמצע, ולקלוט את חלקיקי השומן המחוברים לצינורות השחלות.
  6. אחזו בעדינות בשחלה ובשק ההזדווגות מהקצה האחורי האנכי ופרשו אותו בזהירות כלפי מטה. כדי למנוע נזק במהלך הפתיחה, להעביר את השחלה לתוך צלחת פטרי חדשה או נקייה המכילה מים. להחזיק את קצה השחלה ולפרוש את השחלה פנימה; בזהירות לבצע שלב זה כדי למנוע נזק של השחלות.

5. ניתוח נתונים לאנטומיה של רקמות השחלות

  1. בשלב זה להעריך את התפתחות הביצים עבור כל חרק, בעקבות צבע וגודל הביצים, כדי לשפוט את בגרותו. לאחר מכן, לשפוט את ציון השחלות על פי התפתחות הביצית.
    הערה: החלוקה של רמות התפתחות השחלות השונות מחולקת בעיקר, או לפני הטלת ביצים או התפתחות ביצית עם רמת משקעים חלמון. התפתחות גרגרי הביצה של חרקים מחולקת עוד יותר לשלבים לבהירות רבה יותר כגון, שלב התרחשות החלמון, שלב הבשלות החלמון ושלב מות החלמון. הבשלות של גרגרי הביצה תלויה במלאות, בצבע ובגודל של הביצה כדי לשפוט את בגרותה.
  2. לאחר הנתיחה, הקפידו להפריד את רקמות שקי ההזדווגות של הנקבה מהשחלות השלמות, והתבוננו במורפולוגיה כדי להבדיל בין המינים, מכיוון שרוב האנטומיה של שקי ההזדווגות משתנה ממין למין. לכן, השתמשו בשקי הזדווגות כדי להבחין בין מינים.
  3. בשלב זה, להעריך את האנטומיה השחלות, ולנתח את דירוג התפתחות השחלות. מחלקים את רקמות השחלות לחמש כיתות (כיתה 1 עד כיתה 5).
    1. חפשו את השינויים והמבנה הבאים כדי לארגן את הרקמה: כיתה א' (1) היא שלב מוקדם בהתפתחות (חלבי שקוף), בטן מלאה, רכה, שמנה גוף רכה, צבע בהיר, קשה לקלף. דרגה ב' (2) הוא שלב שקיעת החלמון ומדרגים את השחלות בנפרד במידת הצורך לאחר התבוננות בתעלת השחלות הארוכה והעבה יותר. בכיתה ג' (3) יש פחות גופי שומן ורק כמה גרגירים מחוברים לשחלה. כיתה ד' (4) נראית פחות אלסטית וקלה לשבירה, וחלק מהביציות יכולות להימצא באמצע צינור הרחם. כיתה ה '(5) קל לזהות עם פחות או ללא גוף שומן, שחלות אטרופיות ושבריריות.
  4. צלם תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית לפי צורך ניסיוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התפתחות הביצים
הפרוטוקול הנ"ל יושם כדי לנתח את התפתחות הביציות בשחלה. לשם כך, ראשית, הביצים סווגו באופן כללי לארבעה שלבים כדי להבחין בשלב מוקדם ובשל של התפתחות הביצים בין כל המינים, כגון תולעת שור, תולעת צבא, זחל טארו ועש סלק. כאן נצפה השלב המוקדם של הנוצות (שלב שקוף לבן חלבי). איור 2A מראה שהשחלות עדיין לא החלו להתפתח, צינור השחלות נימה עם גמישות טובה. לא ניתן לדמיין את גרגר הביצה שנוצר באור יום, בשל עדינות הביצים, וניתן לראות כתמים לבנים חלביים עם העברת אור על ידי מתיחת צינור השחלות.

התפתחות השחלות (שלב שקיעת החלמון) מכילה ביצים גדולות, מעט לא בשלות ובצבע לבן חלבי, והביציות נמצאות במגע הדוק (איור 2B). ניתן לראות לידה בוגרת ממתינה (שלב ההבשלה) באיור 2C, הביצים בצורת חרוז ובשלות לחלוטין עם צבע צהוב בהיר. איור 2D מדגים את תקופת הכחדת החלמון (שלב ההשרצה הסופית), שבריריות של צינור השחלה. רוב גרגרי הביצים הפעילים משתחררים, רק מעט או ללא גרגרי ביצים, ואולי ביצים לא פעילות קיימות.

השוואה בין מורפולוגיות של שק הזדווגות
בסך הכל הושוו שמונה מינים נקביים מסוג בר על בסיס שקי הזדווגות. מספר החרקים בכל מין היה יותר מ-100. שק ההזדווגות המייצג ביותר נבחר כדוגמה לתצוגה (איור 3). שק ההזדווגות של Helicoverpa armigera היה סליל ימני עמודי עם לומן פנימי (איור 3A). שק ההזדווגות של Mythimna separata היה בצורת G / קרס דג - בצורת פסים חומים כהים מבפנים (איור 3B). שק ההזדווגות Agrotis ipsilon היה ליניארי, עם סלילים גדולים וציסטות חיצוניות מאחור (איור 3C).

ל-Spaelotis valida (איור 3D) היה שק הזדווגות דק מעט ובצורת J לאחר הגדלה; הוא נראה כמו רגל וצבעו מעט חום. מיני Spodoptera exigua מראים שק לבן שקוף בצורת משקולת עם ציסטה בועתית באמצע, והקצה הדיסטלי לבן חלבי (איור 3E). שק ההזדווגות Spodoptera litura הוא אדום בקצה הפה, וניתן לראות את החלק העליון כשקוף לבן חלבי, והחלל הציסטי הפנימי נראה קלוש (איור 3F). שק ההזדווגות Pseudoptera lepigone הוא שק הזדווגות קטן ומפותל, עם ציסטות חיצוניות שנראות כמו פרח סגור, בעל צבע לבן וחום מלמעלה למטה (איור 3G), ול-Mamestra brassicae יש שק מפותל כפול עם ציסטות חיצוניות בצבע זית (איור 3H).

דירוג התפתחות השחלות אצל נקבות בר נודדות
בדירוג התפתחות השחלות, כיתות א' עד ה' הוערכו ב-4 מיני נקבות מסוג בר, תולעת שור, תולעת צבא, זחל טארו ועש סלק. תוצאות ניתוח דירוג השחלות של תולעי בולוורם (H. armigera) (איור 4) הראו שצינור השחלה שקוף ואלסטי עם ביציות עדינות נראות לעין בדרגה 1 (איור 4A). צינור השחלה שקוף, הביציות צהובות רכות עם עטיפות שקופות בדרגה 2 (איור 4B). בדרגה 3 (איור 4C) לא היו גופי שומן גדולים, רק חלקיקי שומן בודדים היו מחוברים לצינור השחלות. צינור השחלה הוא הארוך והעבה ביותר ליד האוביפוזיטור, יש חלוקה ברורה של אזורים בוגרים, אזורי גדילה ואזורי פרוטו-ביציות, צינור השחלה צהוב ומחרוזת תפילה מלאה. כיתות 4 ו-5 (איור 4D,E) הראו אשכולות ופחות ביציות בשחלות עם צבע צהוב בהיר וירקרק.

באופן דומה, כל חמש דרגות התצפיות נצפו בתולעת צבא (M. separata), כפי שניתן לראות באיור 5. גוף שמן הוא מרקם פלוקולנטי המורכב מחלקיקי שומן מרובים, אווריריים, בהירים בצבע ולבן חלבי עם ביציות עדינות ועדינות. בדרגה 2, מבנה צינור השחלה צהוב ומלא בביציות בצורת חרוז (איור 5B). בעוד שכיתות 3 ו-4 (איור 5C,D) בשלות במלואן, צינור השחלה לבן בצבע קרם, וגרגר הביצה לבן עם עטיפת תלתלים שקופה מבחוץ, הביציות מלאות אך צפופות. דרגה 5 מראה (איור 5E) ירידה בצבע מצהוב לחום כהה; הוא מדגיש את השלב הסופי של השחלה המפותחת.

דירוג השחלות של זחל טארו (S. litura) ועש הסלק (S. exigua) נצפו גם הם באמצעות אותן רמות דירוג שחלות כפי שניתן לראות באיור 6 ובאיור 7. השחלות בדרגות 1 ו-2 (איור 6A,B) של זחל הטארו היו דקות, מוגדלות ובצבע ורדרד בהשוואה לשחלות של עש הסלק (איור 7A,B), שהן לבנות, קצרות, רכות ורחבות. לשתי השחלות דרגות דומות של מורפוגנזה בצינור השחלות, עם ביציות שקופות, אלסטיות ועדינות גלויות. תוצאות של ציונים 3 ו-4 של שני המינים מראות שהשחלות נמצאות באותו שלב של התפתחות, הן צהובות כהות עם ביצים מלאות (איור 6C,D). מצד שני, ניתן לדמיין את אותו שינוי בצבע מכחול שמיים לירק בהיר (איור 7C,D); שינוי צבע זה מצביע על השלב הבוגר של התפתחות השחלה. ביצית מאוחרת הוערכה עם אשכולות ביצים חומים ומעטים באובידוקט (איור 6E). איור 7E מראה שחלה עם אשכולות ביציות דקים ורכים המתארים את התפתחות השחלות בדרגה 5 עבור ביציות, כאשר השחלות נעשות בהדרגה גדולות יותר וכהות יותר בצבען, בצבע לבנבן-כחלחל.

Figure 1
איור 1: כלים שמשמשים לניסויים. הכלים הבסיסיים הדרושים לנתיחת שחלות ושק הזדווגות מחרקים נודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שלבי התפתחות ביציות. שלבי התפתחות ביצים בחרקים נודדים מסוג בר (תולעת שור, תולעת צבא, זחל טארו ועש סלק), (A) שלב שקוף לבן חלבי, (B) שלב שקיעת החלמון, (C) שלב הבשלה, ו-(D) שלב ההשרצה הסופית או תקופת הכחדת החלמון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שקי הזדווגות של חרקים שונים. (A) שק הזדווגות של Helicoverpa armigera; (ב) שק הזדווגות של מיתימנה בנפרד; (ג) שק הזדווגות של אגרוטיס איפסילון; (D) שק הזדווגות של Spaelotis valida; (E) שק הזדווגות של Spodoptera exigua; (F) שק הזדווגות של Spodoptera litura; (G) שק הזדווגות של Athetis lepigone; (H) שק הזדווגות של Mamestra brassicae. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דירוג התפתחות השחלות של Helicoverpa armigera. (א) כיתה 1 (תקופה שקופה חלבית); (B) דרגה 2 מייצגת את תקופת התפתחות השחלות (תקופת שקיעת החלמון); (ג) דרגה 3 מראה תקופת בגרות; (ד) דרגה 4 מציינת את דרגת ההשרצה; ו- (E) דרגה 5 מייצגת אוביפוזיציה מאוחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דירוג התפתחות השחלות של Mythimna separata. (A) דרגה 1 (תקופה שקופה חלבית); (B) דרגה 2 מייצגת את תקופת התפתחות השחלות (תקופת שקיעת החלמון); (ג) דרגה 3 מראה תקופת בגרות; (ד) דרגה 4 מציינת את רמת ההשרצה; (E) דרגה 5 מייצגת אוביפוזיציה מאוחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: דירוג התפתחות השחלות של Spodoptera litura. (A) דרגה 1 (תקופה שקופה חלבית); (B) דרגה 2 מייצגת את תקופת התפתחות השחלות (תקופת שקיעת החלמון); (ג) דרגה 3 מראה תקופת בגרות; (ד) דרגה 4 מציינת את רמת ההשרצה; (E) דרגה 5 מייצגת אוביפוזיציה מאוחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: דירוג התפתחות השחלות של Spodoptera exigua. (A) דרגה 1 (תקופה שקופה חלבית); (B) דרגה 2 מייצגת את תקופת התפתחות השחלות (תקופת שקיעת החלמון); (ג) דרגה 3 מראה תקופת בגרות; (ד) דרגה 4 מציינת את רמת ההשרצה; (E) דרגה 5 מייצגת אוביפוזיציה מאוחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות ניתוח שחלות משמשות באופן שגרתי להגנת הצומח, כדי להבהיר את תנועת מעוף החרקים ואוכלוסיית החרקים לחיזוי 19,20,21 ולפרט את השינויים הפיזיולוגיים בחרקים. הבחינו כי יכולת הנדידה הייחודית ויכולת הפיזור המהירה של מזיקים חקלאיים נפוצים, כגון תולעי שור, תולעי צבא, זחל טארו ועש סלק, מקשים על חיזוי מאזורים אחרים. כמה מחקרים החשיבו את Athetis lepigone כמזיק נודד 22,23, אך דינמיקת הנדידה והחיזוי של מזיק זה חמקמק. לאחרונה הוצגה שיטת לכידת אור נוספת בה נעשה שימוש בנורות זרקור של 1000 וואט לניטור מזיקים נודדים18,24, שיש לה השפעה יישומית טובה על ניטור מזיקים נודדים. כמו כן, משערים כי שיטות לכידת אור אינן מספיקות כדי להבחין בין חרקים נודדים. במחקר זה, בשיא הנדידה, מספר הפרטים הבוגרים שנתפסו במלכודת זרקורים היו בעיקר מזיקים נודדים, בעוד שמספר הפרטים האזוריים היה זניח. זה מדגיש כי תקופת הופעתם של מינים נודדים דומה למדי25. כדי להימנע מאינדיבידואלים אזוריים, חשוב לקחת בחשבון את תקופת השיא של הנדידה כדי ללכוד שפע של פרטים מהגרים. לכן, זיהוי חרקים נודדים עם מנורות זרקור ודירוג השחלות הם שני היבטים בסיסיים. עם זאת, יש רק קומץ שיטות לזהות את האנטומיה השחלתית של חרקים נודדים 13,26,27,28,29. השיטה הישימה המוצגת כאן היא עבודה חדשנית הקובעת את השימוש הן ברקמות השחלה, הן בשקי ההזדווגות והן בדירוג השחלות, כדי להבחין בין שלבי התפתחות שונים וניסתה לדון בתכונות מורפוגנזה של רקמות שחלה בפירוט רב יותר מאשר מחקרים קודמים 11,21,30; במיוחד ביחס למזיקים הנקביים המסוכנים ביותר, כגון H. armigera31, M. separata32 ו- S. litura33 שנלכדו באמצעות מנורות זרקור.

רוב המחקרים הקודמים סיווגו את התפתחות השחלות באמצעות שיטות הבחנה להערכת זיהוי חרקים נודדים. המוקד של מחקרים אלה היה בשלות צבע של חלמון, ביצית, התפתחויות לידה, תדירות הזדווגות, וכו '22,30,34,35. השיטה בה נעשה שימוש במחקר זה הציגה ראיות השוואתיות דו-כיווניות, המבוססות על שתי רקמות שחלות. עבור תולעת השור, תולעת הצבא, זחל טארו, עש הסלק, Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Athetis lepigone ו- Mamestra brassicae, נחקרו שקי הזדווגות. שלבי התפתחות גרגרי הביצים הוערכו ישירות ב- Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura ו- Spodoptera exigua עבור האנטומיה השחלתית. על פי האנטומיה של נקבת החרק השחלות הבוגרות, התפתחות הביצית משתנה ממין למין 16,17,36,37. לכן, כדאי לחקור את מורפולוגיות השחלות בשתי הרמות של החרקים הנודדים על ידי ניתוח דרגות התפתחות השחלות ושקי הזדווגות באמצעות שיטת דיסקציה זו.

בדרך כלל, אחסון לטווח ארוך או לא נכון, כגון תנודות בלחות, בטמפרטורה ובמקור המזון של החרקים הכלואים באמצעות מנורות זרקור עלול להשפיע על משקל הגוף, בריאות הביציות וגודל השחלה 5,38,39,40,41,42. הדבר מוביל לקושי במיון ונתיחת חרקים בשלב מאוחר יותר ומוביל לנתונים חלקיים. כדי למזער שגיאות אלה, יש צורך באחסון לטווח קצר ומתאים. בנוסף, לאחר החלת הפרוטוקול, נבחרו נקבות בגודל דומה. בחירה ואיסוף זה של נקבות חוסך זמן, עם תוצאות מהירות ומשמעותיות במחקר הנוכחי. שיטה זו מדגימה את הנתיחה של חרקים נודדים בוגרים מסוג בר מהסביבה הטבעית ואת הדירוג השחלתי שלה. כדי לבצע פרוטוקול זה עם תוצאות יעילות, יש לשקול כמה צעדים קריטיים. לדוגמה, ברירה של חרקים מהסביבה הטבעית היא צעד מכריע במניעת שחלות ריקות וביציות לא פוריות; החרק החי עם איברי רקמות שלמים עדיף, הימנעות חרקים מתים, חלשים, שבורים או מכווצים בחלל הבטן.

בהתאם לכך, ניתן להעריך את הדיסקציה של רקמות השחלה על ידי השוואת שיפועים שחלתיים כגון בדירוג השחלות של תולעי בול (H. armigera) (איור 4), ביציות מבשילות מאוגוניה לבנה ושקופה בשחלות לצהוב כהה. הטלת ביצים מפוזרת (איור 5) מתרחשת בתולעי צבא שבהן השחלות מבשילות מאוגוניה לבנה חלבית ושקופה ונראות לבנות חלביות או צהובות בהירות. זחל טארו הראה התפתחות אלכסונית מתאי אוגוניה שקופים לבנים חלביים שהיו ורודים ורכים, והתבגרו בהמשך עם צבע חום או צהוב (איור 6). המשך עבודה זו קובע את האנטומיה השחלתית במינים שונים בו זמנית. פרקטיקה זו תסייע בתחום הגנת הצומח לחקור את תנועת החרקים ויכולה להנחות חיזוי מזיקים.

נכון לעכשיו, למחקר זה יש כמה מגבלות. היישום של שיטה זו תלוי בניתוח מפורט של גרגרי ביצה ותכונות התפתחות השחלות. אתגר עתידי מתמשך מרכזי הוא לקדם ולשפר עוד יותר ניתוח מבוסס שדה כדי להעריך את דינמיקת הנדידה של נקבות מזיקים במערכת האקולוגית. לכן, יש צורך לשלב נתוני שדה לניתוח סטטיסטי, מכיוון שדירוג השחלות מושפע מגורמים סביבתיים כגון כימות שנתי של חרקים נודדים, טמפרטורה, לחות, כיוון הרוח של האתר והמזון ועוד. ההנחה הייתה שלכל המינים יהיו אותן רמות דירוג שחלות וקפסולות הזדווגות. עם זאת, יש לאמת אותו עם מינים דומים יחסית, שכן זמינות החרקים בטבע משתנה ועלולה לגרום לחוסר חיזוי. לכן, עדיין יש צורך לאמת את הנתיחה של מינים דומים של נקבות מהגרות בגובה רב באמצעות שתי רקמות שחלה בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט החדשנות המדעית והטכנולוגית הגדול (2020CXGC010802).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital camera Canon ( China ) co., LTD EOS 800D
Dropper Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Ethanol absolute (99.7%) Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Forceps  Vetus Tools co., LTD ST-14
GT75 type halogen headlamp (1000 W) Shanghai Yadeng Industry co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China
Measuring cylinder, beaker, flask Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net bag  Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD 0.5 m 
Net cages  Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD 30 cm x 30 cm
Petri dishes Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD  60 mm diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, K. Monitoring and management strategy for Helicoverpa armigera resistance to Bt cotton in China. Journal of Invertebrate Pathology. 95 (3), 220-223 (2007).
  2. Jiang, X., Luo, L., Zhang, L., Sappington, T. W., Hu, Y. Regulation of Migration in Mythimna separata (Walker) in China: A Review Integrating Environmental, Physiological, Hormonal, Genetic, and Molecular Factors. Environmental Entomology. 40 (3), 516-533 (2011).
  3. Su, J., Lai, T., Li, J. Susceptibility of field populations of Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae) in China to chlorantraniliprole and the activities of detoxification enzymes. Crop Protection. 42, 217-222 (2012).
  4. Che, W., Shi, T. Insecticide Resistance Status of Field Populations of Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) From China. Journal of Economic Entomology. 106 (4), 1855-1862 (2013).
  5. Jiang, X., Luo, L. Regulation of Migration in Mythimna separata (Walker) in China: A Review Integrating Environmental, Physiological, Hormonal, Genetic, and Molecular Factors. Environmental Entomology. 40 (3), 516-533 (2011).
  6. Kiss, M., Nowinszky, L., Puskás, J. Examination of female proportion of light trapped turnip moth (Scotia segetum Schiff.). Acta Phytopathologica Et Entomologica Hungarica. 37, 251-256 (2002).
  7. Jiang, X. F., Luo, L. Z., Sappington, T. W. Relationship of flight and reproduction in beet armyworm, Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae), a migrant lacking the oogenesis-flight syndrome. Journal of insect physiology. 56 (11), 1631-1637 (2010).
  8. Sun, Y., Chen, R., Wang, S., Bao, X. Morphological observation on the development of female reproductive system in meadow moth Loxostege sticticalis L. Acta Entomologica Sinica. 34, 248-249 (1991).
  9. Fu, X., Feng, H., Liu, Z., Wu, K. Trans-regional migration of the beet armyworm, Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae), in North-East Asia. PLoS One. 12 (8), e0183582 (2017).
  10. Cusson, M., McNeil, J. N., Tobe, S. S. In vitro biosynthesis of juvenile hormone by corpora allata of Pseudaletia unipuncta virgin females as a function of age, environmental conditions, calling behaviour and ovarian development. Journal of Insect Physiology. 36 (2), 139-146 (1990).
  11. Fu, X. W., et al. Seasonal migration of Cnaphalocrocis medinalis (Lepidoptera: Crambidae) over the Bohai Sea in northern China. Bulletin of entomological research. 104 (5), 601-609 (2014).
  12. Telfer, W. H. Egg formation in Lepidoptera. Journal of Insect Science. 9, 1-21 (2009).
  13. Wu, K., Guo, Y., Wu, Y. Ovarian development of adult females of cotton bollworm and its relation to migratory behavior around Bohai bay of China. Acta Ecologica Sinica. 22 (7), 1075-1078 (2002).
  14. Wada, T., Ogawa, Y., Nakasuga, T. Geographical difference in mated status and autumn migration in the rice leaf roller moth, Cnaphalocrocis medinalis. Entomologia Experimentalis et Applicata. 46 (2), 141-148 (1988).
  15. Xingquan, K., Calvin, D. D. Female European corn borer (Lepidoptera: Crambidae) ovarian developmental stages: Their association with oviposition and use in a classification system. Journal of economic entomology. 97 (3), 828-835 (2004).
  16. Ge, S., et al. Potential trade-offs between reproduction and migratory flight in Spodoptera frugiperda. Journal of insect physiology. 132, 104248 (2021).
  17. Han, L. Z., Gu, H. N. Reproduction-Flight Relationship in the Beet Armyworm, Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental Entomology. 37 (2), 374-381 (2008).
  18. Zhou, Y., et al. Long-term insect censuses capture progressive loss of ecosystem functioning in East Asia. Science Advances. 9 (5), eade9341 (2023).
  19. Hu, G., Lim, K. S., Horvitz, N. Mass seasonal bioflows of high-flying insect migrants. Science. 354 (6319), 1584-1587 (2016).
  20. Hu, G., et al. Environmental drivers of annual population fluctuations in a trans-Saharan insect migrant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (26), e2102762118 (2021).
  21. Fu, X., Liu, Y., Li, C. Seasonal migration of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae) over the Bohai Sea in northern China. Journal of Economic Entomology. 107 (4), 1399-1410 (2014).
  22. Fu, X., Liu, Y., Li, Y., Ali, A., Wu, K. Does Athetis lepigone Moth (Lepidoptera: Noctuidae) Take a Long-Distance Migration. Journal of Economic Entomology. 107 (3), 995-1002 (2014).
  23. Huang, J., et al. The Effect of Larval Diet on the Flight Capability of the Adult Moth (Athetis lepigone) (Möschler) (Lepidoptera: Noctuidae). Florida Entomologist. 105 (4), 287-294 (2023).
  24. Sun, X., Hu, C., Jia, H. Case study on the first immigration of fall armyworm, Spodoptera frugiperda invading into China. Journal of Integrative Agriculture. 20 (3), 664-672 (2021).
  25. Feng, H. Q., Wu, K. M., Cheng, D. F., Guo, Y. Y. Northward migration of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and other moths in early summer observed with radar in northern China. Journal of Economic Entomology. 97 (6), 1874-1883 (2004).
  26. Ge, S. S., et al. Flight activity promotes reproductive processes in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Journal of Integrative Agriculture. 20 (3), 727-735 (2021).
  27. Guerra, P. A., Pollack, G. S. Flight behaviour attenuates the trade-off between flight capability and reproduction in a wing polymorphic cricket. Biology Letters. 5 (2), 229-231 (2009).
  28. He, W., Zhao, X., Ge, S., Wu, K. Food attractants for field population monitoring of Spodoptera exigua (Hübner). Crop Protection. 145, 105616 (2021).
  29. He, L. M., et al. Adult nutrition affects reproduction and flight performance of the invasive fall armyworm, Spodoptera frugiperda in China. Journal of Integrative Agriculture. 20 (3), 715-726 (2021).
  30. Kongming, W., Yuyuan, G., Yan, W. Ovarian development of adult females of cotton bollworm and its relation to migratory behavior around Bohai Bay of China. Acta Ecologica Sinica. 22 (7), 1075-1078 (2002).
  31. Feng, H., Wu, X. Seasonal Migration of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) Over the Bohai Sea. Journal of Economic Entomology. 102 (1), 95-104 (2009).
  32. Miao, J., Guo, P., Li, H. Low Barometric Pressure Enhances Tethered-Flight Performance and Reproductive of the Oriental Armyworm, Mythimna separata (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Economic Entomology. 114 (2), 620-626 (2021).
  33. Fu, X., Zhao, X. Seasonal Pattern of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) Migration Across the Bohai Strait in Northern China. Journal of Economic Entomology. 108 (2), 525-538 (2015).
  34. Rhainds, M., Kettela, E. G. Oviposition threshold for flight in an inter-reproductive migrant moth. Journal of Insect Behavior. 26 (6), 850-859 (2013).
  35. Showers, W. B. Migratory ecology of the black cutworm. Annual review of entomology. 42, 393-425 (1997).
  36. Zhang, Z., et al. Morphological differences of the reproductive system could be used to predict the optimum Grapholita molesta (Busck) control period. Scientific Reports. 7 (1), 8198 (2017).
  37. Zheng, D. B., Hu, G., Yang, Ovarian development status and population characteristics of Sogatella furcifera (Horváth) and Nilaparvata lugens (Stål): implications for pest forecasting. Journal of Applied Entomology. 138 (1-2), 67-77 (2014).
  38. Wan, G. J., Jiang, S. L. Geomagnetic field absence reduces adult body weight of a migratory insect by disrupting feeding behavior and appetite regulation. Insect Science. 28 (1), 251-260 (2021).
  39. Laštůvka, Z. Climate change and its possible influence on the occurrence and importance of insect pests. Plant protection science. 45, S53-S62 (2009).
  40. Xu, R. B., Ge, S. S. Physiological and Environmental Influences on Wingbeat Frequency of Oriental Armyworm, Mythimna separata (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental Entomology. 52 (1), 1-8 (2022).
  41. Jiang, X., Cai, B. Influences of temperature and humidity synthesize on flight capacity in the moth s of Oriental armyworm, Mythimna separata(Walker). Acta Ecologica Sinica. 23 (4), 738-743 (2003).
  42. Zhang, L., Luo, L., Jiang, X. Starvation influences allatotropin gene expression and juvenile hormone titer in the female adult oriental armyworm, Mythimna separata. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 68 (2), 63-70 (2008).

Tags

דיסקציה דירוג התפתחות השחלות נקבות חרקים מסוג בר חרקים נודדים ייצור מזון ביטחון מלכודות זרקורים זיהוי מינים נודדים ניתוח מערכת הרבייה שק הזדווגות שחלות דירוג התפתחותי שחלות Helicoverpa armigera Mythimna separata Spodoptera litura Spodoptera exigua Agrotis ipsilon Spaelotis Valida Athetis lepigone Mamestra brassicae שיטת דיסקציה
דיסקציה ודירוג התפתחות השחלות בנקבות חרקים מסוג בר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sindhu, L., Guo, S., Song, Y., Li,… More

Sindhu, L., Guo, S., Song, Y., Li, L., Cui, H., Guo, W., Lv, S., Yu, Y., Men, X. Dissection and Grading of Ovarian Development in Wild-Type Female Insects. J. Vis. Exp. (197), e65644, doi:10.3791/65644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter