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Biology

慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

doi: 10.3791/680 Published: February 15, 2008

Summary

このビデオとプロトコルは、げっ歯類のガラスで覆われた頭蓋窓を移植する方法を示します。これらの製剤は、数ヶ月の時間スケール上の新皮質のin vivo二光子励起イメージングで慢性的に使用することができます。また、光内因性信号のイメージングなどのイメージング、他の種類、使用することができる。

Abstract

イメージング技術は、研究の脳機能においてますます重要になっています。それはライブをそのまま脳の研究を可能にするためそれらの間で、二光子レーザー走査顕微鏡は、非常に有用な方法として浮上している。適切な準備を、このテクニックは、数分から数ヶ月に、慢性的に同一の皮質領域の観察が可能になります。このビデオでは、我々は二光子顕微鏡を用いて脳のin vivoイメージング慢性の準備を示しています。このテクニックは、最初に現在Janeliaファームでハワードヒューズ医学研究所の研究者である博士カレルスボボダ、によって開拓された。ここに示したような調製物は、カルシウム感受性色素を用いて神経活動を記録するために、(例えば、樹状突起と軸索の力学)新皮質の構造のイメージングに使用することができます、画像皮質血流の力学への、または内因性光学イメージングの研究のために。新皮質の深い画像が最適な頭蓋窓の手術で可能です。手術時の硬膜を損傷しないように細心の注意を払って使用してと一緒に、感染症を避けるために、可能な限り無菌条件下で動作し、成功と長期的なガラス張りの頭蓋のウィンドウになります。

Protocol

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  1. IACUC承認された手順を使用して、イソフルランによるマウス(誘導は4%、手術のための1.5から2パーセント)を麻酔。尾及び/またはTOEのつまみが動物を完全に鎮静されていることを確認するために使用されていることが重要です。
  2. げっ歯類のトリマを使用して、上の目に首の後ろから髪を剃る。
  3. 手術の水再循環ブランケットを介して、定位固定フレームにマウスを置きます。しっかりと耳を棒で頭を固定します。
  4. 乾燥から動物の目を防ぐために、眼軟膏を適用します。
  5. それぞれ、脳および/または炎症反応の腫れを防ぐために、皮下、管理デキサメタゾン(0.2 mg / kg体重)とカルプロフェン(5 mg / kg体重)。
  6. 手術を始める前に、70%アルコールとbetadineの三交互にスワイプで皮膚を拭いて動作領域を滅菌する。
  7. すべての手術器具は、ガラスビーズ滅菌器を使用して事前に滅菌されています。エタノールで滅菌されたはさみを使用して、2つの吻側方向へのカット、ほとんどまぶたに達し、二つの斜めカットに続くすべての頭部のベースに沿って水平方向のカット、で始まる、頭蓋骨の上に皮膚を取り除くそれは、正中線に収束する。
  8. リドカイン+エピネフリンの溶液の液滴は、過剰な出血や痛みを避けるために、骨膜の上に、この時点で適用されます。メスで、頭蓋骨の縁に骨膜を引っ込める。また、軽く首の後ろの筋肉を引っ込める。
  9. 穏やかに乾燥した表面を作成するためにメスで頭蓋骨の全体の露出面積を削る。後で適用されたとき、それは接着剤が良く付着できるようになりますので、これは非常に重要です。
  10. イメージングサイトが選択されると、一つは頭蓋のウィンドウを作成する準備ができています。最初に、静かに空気歯科用ドリルで直径約4 mmの円を"描く"。
  11. わずかな掘削した後、頭蓋骨の表面に再びリドカイン+エピネフリンのソリューションを適用する。骨の非常に薄い層が残っている掘削を停止します。それは道を与えるか感じるように開頭の中央に軽く押すことで、一つは通常、この段階に到達したことを知ることができます。
  12. 骨の海綿構造 - - 骨梁の生理食塩水と取る利点の低下の下で非常に細い先端の鉗子で頭蓋骨から開頭を持ち上げて外します。それは頭蓋骨を持ち上げと硬膜の出血を防ぐのを助けるので生理食塩水は、重要です。
  13. 以前に頭蓋骨が削除されるとき、時々発生した小さな出血を止めるために硬膜に生理食塩水に浸したされたGelfoamを適用します。
  14. 硬膜の表面を乾燥や出血がないことを確認した後、ゆっくりと硬膜の上に滅菌5 mmのガラス製カバースリップを置く。 ( :他のグループも、硬膜上に低融点アガロース(1.2%)の低下を置き、寒天の上にカバースリップを置く)。
  15. 頭蓋骨上の反対側の半球にcyanocrylateベースの接着剤の滴を適用します。ガラスの下に置くように注意しながらしながら針の助けを借りて、ゆっくりとすべてのウィンドウの周囲に接着剤を適用する。接着剤は、現在頭蓋骨の表面全体に薄い層に適用することができます。
  16. 接着剤が乾燥したら、それを確保するため、また、カバースリップの小さな縁をカバーする、頭蓋骨の表面全体に歯のアクリルをミックスし、それを適用します。
  17. カバースリップを確保した後、歯科用アクリルを使用してウィンドウの周りに小さな井戸を行います。また、歯科アクリルのチタン棒を埋め込みます。このバーは、後のイメージングのための顕微鏡のステージにしっかりとマウスを接続するために使用されます。それは頭蓋窓と平行になるように、バーが水平であることを確認することが重要です。バーの下に一枚の紙を置くと、アクリルが硬化しながらバーのレベルを維持できるようにすることができます。
  18. 歯科アクリルが10分間(強化)硬化され、その時点でチタン棒を所定の位置に固定されています。それが回復するまでは暖かいケージに動物を置きます。
  19. 麻酔から回復した後、動物は、同じ日に結像することができます。

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Discussion

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我々はビデオでと補足の図で示したように、二光子顕微鏡の使用と組み合わせて頭蓋窓の準備は、、in vivoで新皮質の構造と機能を研究する非常に強力なツールです。テクニックは、関連する解剖学的構造と微細な外科的処置とこの準備が必要とするスキルに精通する厳しい訓練が必要です。だけ自然のままの手術は、慢性的イメージングに使用することができます。硬膜が過度またはパンクした操作される場合、製剤は、イメージングには使用しないでください。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Carprofen (Rimadyl) Drug Pfizer Pharma GmbH
Isoflurane (Aerrane) Surgery Baxter Internationl Inc.
Dexamethasone Drug Baxter Internationl Inc.
Ortho-Jet Powder Reagent LANG To be mixed with the acrylic
Jet-Acrylic Liquid Reagent LANG To be mixed with Ortho-Jet Powder
Round Glass Cover Slip Tool Electron Microscopy Sciences 72195-05 5 mm diameter
Gelfoam Surgery Pharmacia Corporation (Pfizer)
Titanium bars are custom-made

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References

  1. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
  2. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
  3. Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
  5. Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680, doi:10.3791/680 (2008).More

Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680, doi:10.3791/680 (2008).

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