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Biology

Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

doi: 10.3791/680 Published: February 15, 2008

Summary

Este video y el protocolo de demostrar cómo la implantación de una cubierta de cristal ventana craneal en los roedores. Estas preparaciones se pueden utilizar para la crónica en vivo de dos fotones de imágenes de la corteza cerebral en escalas de tiempo de meses. También puede ser utilizado para otros tipos de imágenes, incluyendo imágenes ópticas señal intrínseca.

Abstract

Las técnicas de imagen son cada vez más importante en la función cerebral de estudio. Entre ellos, dos fotones microscopía de escaneo láser se ha convertido en un método muy útil, porque permite el estudio del cerebro intacto en vivo. Con los preparativos adecuados, esta técnica permite la observación de la zona cortical misma crónica, de minutos a meses. En este vídeo, se muestra una preparación para la crónica en imágenes in vivo del cerebro usando la microscopía de dos fotones. Esta técnica fue inicialmente promovida por el Dr. Karel Svoboda, quien es ahora un Howard Hughes Medical Institute en la Granja Janelia. Preparaciones como la que se muestra aquí se puede utilizar para obtener imágenes de la estructura neocortical (por ejemplo, la dinámica, dendríticas y axonal), para registrar la actividad neuronal con tintes sensibles al calcio, a la imagen de la dinámica del flujo sanguíneo cortical, o para los estudios de imagen óptica intrínseca. Imágenes profundas de la corteza cerebral es posible con óptima cirugías ventana craneal. Operando bajo las condiciones más estériles posible para evitar infecciones, junto con el uso de un cuidado extremo para no dañar la duramadre durante la cirugía, se traducirá en éxito y duradera cubierta de cristal y craneal.

Protocol

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  1. Anestesiar a los ratones con isoflurano (4% para la inducción, 1,5-2% para la cirugía) con IACUC los procedimientos aprobados. Es importante que la cola y / o aprieta los pies se utilizan con el fin de garantizar que el animal está completamente sedado.
  2. Uso de un optimizador de roedores, se afeitan el pelo de la parte posterior del cuello hasta los ojos.
  3. Coloque el ratón en un marco estereotáxico, más de una cirugía de agua de recirculación de manta. Sujetar firmemente la cabeza con barras de oído.
  4. Aplicar pomada para los ojos, con el fin de evitar que el ojo del animal que se sequen.
  5. Administrar por vía subcutánea, dexametasona (0,2 mg / Kg) y carprofeno (5 mg / Kg) para prevenir la inflamación del cerebro y / o una respuesta inflamatoria, respectivamente.
  6. Antes de comenzar la cirugía, la esterilización de la zona de trabajo limpiando la piel con tres golpes alternados de 70% de alcohol y betadine.
  7. Todos los instrumentos quirúrgicos se han pre-esterilizados utilizando un esterilizador de cuentas de vidrio. Con la tijera que han sido esterilizadas con etanol, quitar la piel sobre la parte superior del cráneo, a partir de un corte horizontal a lo largo de la base de la cabeza, seguido por dos cortes en la dirección rostral, casi llegando a los párpados, luego dos cortes oblicuos que convergen en la línea media.
  8. Una gota de solución de lidocaína con adrenalina + se aplica en este punto en el periostio para evitar el sangrado excesivo o dolor. Con un bisturí, retirar el periostio de los bordes del cráneo. Además, la ligera retracción de la musculatura de la parte posterior del cuello.
  9. Raspe suavemente toda la superficie expuesta del cráneo con el bisturí para crear una superficie seca. Esto es muy importante, ya que permitirá que el pegamento se adhiera mejor cuando se aplica más tarde.
  10. Una vez que un sitio de imágenes ha sido elegido, uno está listo para crear la ventana del cráneo. En primer lugar, con suavidad "dibujar" un círculo de unos 4 mm de diámetro con el taladro neumático dental.
  11. Después de una ligera perforación, aplicar lidocaína solución de epinefrina + nuevo en la superficie del cráneo. Detener la perforación, cuando una capa muy delgada de hueso que queda. Presionando suavemente sobre el centro de la craneotomía para sentir cómo se le da forma, por lo general se puede saber que se alcanza esta etapa.
  12. En una gota de solución salina y las ventajas de tomar de las trabéculas óseas - la estructura esponjosa del hueso - elevación de distancia de la craneotomía en el cráneo con unas pinzas punta muy fina. La solución salina es importante, ya que ayudará a levantar la cabeza y evitar el sangrado de la duramadre.
  13. Aplicar Gelfoam que ha sido previamente lavadas con solución salina a la duramadre para detener cualquier sangrado pequeño que a veces ocurre cuando el cráneo es removido.
  14. Después de secar la superficie de la duramadre y la garantía de que no hay sangrado, mucho cuidado, coloque un recipiente estéril de vidrio de 5 mm hoja de la cubierta en la parte superior de la duramadre. (Nota: otros grupos también se coloca una gota de bajo punto de fusión de agarosa (1,2%) a lo largo de la dura y poner el cubreobjetos en la parte superior del agar).
  15. Aplique una gota de pegamento a base de cianoacrilato para el hemisferio opuesto en el cráneo. Con la ayuda de una aguja, aplique el pegamento alrededor de la ventana, mientras que teniendo cuidado de no ponerlo en el vaso. Pegue ahora se puede aplicar en una capa fina sobre toda la superficie del cráneo.
  16. Una vez que el pegamento se haya secado, mezcla de acrílico dental y aplicarlo en toda la superficie del cráneo, que abarca también un pequeño borde de la hoja de la cubierta, para asegurarla.
  17. Después de obtener la hoja de la cubierta, hacer un pequeño pozo alrededor de la ventana con acrílico dental. Además, integrar una barra de titanio en el acrílico dental. Esta barra se utilizarán posteriormente para conectar el ratón con seguridad en la platina del microscopio para obtener imágenes. Es importante asegurarse de que el bar está a nivel, de modo que sea paralelo a la ventana del cráneo. Colocar una hoja de papel debajo de la barra se puede permitir que la barra de permanecer nivel, mientras que el acrílico se endurezca.
  18. El acrílico dental se deja curar (endurecer) durante 10 minutos, momento en que la barra de titanio se fija en su lugar. Colocar el animal en una jaula caliente hasta que se recupere.
  19. Después de la recuperación de la anestesia, el animal se pueden obtener imágenes en el mismo día.

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Discussion

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Como hemos mostrado en el video y en las figuras complementarias, la preparación de la ventana del cráneo, combinada con el uso de la microscopia de dos fotones, es una herramienta muy poderosa para estudiar in vivo la estructura y función del neocórtex. La técnica requiere de un riguroso entrenamiento para familiarizarse con la anatomía pertinente y los procedimientos quirúrgicos muy bien y las habilidades que requiere esta preparación. Sólo cirugías originales pueden ser utilizados para obtener imágenes de crónica. Si la duración es manipulado en exceso o se perfora, la preparación no debe ser utilizado para obtener imágenes.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Carprofen (Rimadyl) Drug Pfizer Pharma GmbH
Isoflurane (Aerrane) Surgery Baxter Internationl Inc.
Dexamethasone Drug Baxter Internationl Inc.
Ortho-Jet Powder Reagent LANG To be mixed with the acrylic
Jet-Acrylic Liquid Reagent LANG To be mixed with Ortho-Jet Powder
Round Glass Cover Slip Tool Electron Microscopy Sciences 72195-05 5 mm diameter
Gelfoam Surgery Pharmacia Corporation (Pfizer)
Titanium bars are custom-made

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References

  1. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
  2. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
  3. Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
  5. Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas
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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680, doi:10.3791/680 (2008).More

Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680, doi:10.3791/680 (2008).

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