Summary
इस वीडियो में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट रंजक के साथ mesenchymal स्टेम सेल की लेबलिंग के लिए तकनीक से पता चलता है. इस तकनीक vivo में एक ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ प्रतिरोपित स्टेम कोशिकाओं की ट्रैकिंग के लिए और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ histopathological सहसंबंध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
ऑप्टिकल इमेजिंग (पुराना) के नए स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के vivo निगरानी में के लिए एक आसान, तेज, और सस्ती उपकरण है. एक फ्लोरोसेंट रंजक, लेबल कोशिकाओं और विशिष्ट लक्ष्य अंगों या विकृतियों में उनके संचय के दृश्य के बाद अंतःशिरा इंजेक्शन के साथ स्टेम सेल के पूर्व vivo लेबलिंग तकनीक पर आधारित है. प्रस्तुत तकनीक दर्शाता है कि कैसे हम lipophilic फ्लोरोसेंट रंजक के साथ सरल ऊष्मायन द्वारा मानव mesenchymal स्टेम सेल (hMSC) लेबल (C67H103CIN2O3S) किया है और हम कैसे के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) लेबल एफडीए को मंजूरी दी फ्लोरोसेंट डाई ग्रीन (भारतीय तट रक्षक) Indocyanine. तेज पालन और फॉस्फोलिपिड सेल झिल्ली bilayer भर lypophilic डाई के प्रसार तंत्र के माध्यम से है. लेबलिंग दक्षता आम तौर पर अगर कोशिकाओं के रूप में सीरम युक्त मीडिया में ऊष्मायन करने का विरोध किया सीरम मुक्त मीडिया में रंग के साथ incubated हैं सुधार है. इसके अलावा, अभिकर्मक एजेंट Protamine सल्फेट के अलावा काफी विपरीत एजेंट तेज सुधार.
Protocol
फ्लोरोसेंट रंजक के साथ mesenchymal स्टेम सेल के लेबल क्या
- Mesenchymal स्टेम सेल की लेबलिंग के लिए प्रक्रिया शुरू trypsinize, और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए कक्षों की एक निर्धारित संख्या के साथ एक निलंबन मिल.
- इनक्यूबेटर की कोशिकाओं से बाहर ले लो और कोशिकाओं को लेबल किया जा युक्त बोतल से बाहर पुराने मीडिया aspirate
- मिलीग्राम / Ca - मुक्त पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें. बाहर पीबीएस Aspirate. मिलीग्राम और Ca trypsin बाधित होता है, इसलिए हम इन बिना पीबीएस उपयोग.
- पूर्व गर्म trypsin 0.05% एक T75 फ्लास्क हम 5ml उपयोग के लिए जोड़ें. सुनिश्चित करें कि कुप्पी की पूरी सतह को कवर किया है.
- के बारे में 5 मिनट के लिए 37 ° सी में इनक्यूबेटर में सेते हैं.
- माइक्रोस्कोप के तहत टुकड़ी की पुष्टि करें. यदि कोशिकाओं को अभी भी फ्लास्क का पालन करने के लिए, यह कुछ समय नल और थोड़ी देर रुको जब तक trypsinization सफल है.
- अब, यह 10% FCS युक्त मीडिया जोड़कर trypsin बेअसर करने के लिए आवश्यक है. हम मीडिया के एक बराबर राशि का उपयोग के रूप में वहाँ trypsin है.
- पिपेट और नीचे कुछ बार करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं रहे हैं मीडिया में फिर से निलंबित कर दिया.
- सेल एक बाँझ 15ml छाया polypropylene ट्यूब समाधान स्थानांतरण.
- 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
- सेल गोली परेशान नहीं यह सुनिश्चित करने के सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
- Resuspend DMEM में कोशिकाओं और सेल गिनती के साथ आगे बढ़ना.
- 1x10 के घनत्व में लेबल किया जा ^ मिलीलीटर प्रति सीरम मुक्त संस्कृति मध्यम (DMEM) में 6 कोशिकाओं निलंबित.
- यह सेल निलंबन के सभी तैयारी थी. अब, यह लेबलिंग शुरू करने के लिए तैयार है.
- सबसे पहले, सेल निलंबन के मिलीलीटर प्रति विपरीत एजेंट के 5 μL जोड़ें.
- फिर, धीरे pipetting से समाधान मिश्रण.
- 37 पर लेबलिंग समाधान ° 6 अच्छी तरह से कम लगाव पकवान में 20 मिनट के लिए सी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
- एक बार सरल ऊष्मायन पूरा हो गया है, यह आवश्यक है एक 15 मिलीलीटर छाया polypropylene ट्यूब सेल समाधान हस्तांतरण.
- यह नीचे 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
- लेबलिंग मध्यम Aspirate, सेल गोली परेशान नहीं यह सुनिश्चित करने के.
- पीबीएस के साथ कोशिकाओं धो. कोशिकाओं विंदुक ऊपर और नीचे, कक्ष गोली तोड़ने सुनिश्चित करने.
- बाद के दो चरणों में दो बार दोहराएँ, तो वहाँ 3 धोने कदम के एक कुल है.
- गणना कोशिकाओं और सेल व्यवहार्यता का निर्धारण एक Trypan नीले परीक्षण प्रदर्शन. ये मानक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल है कि हम यहाँ की व्याख्या करने के लिए नहीं जा रहे हैं.
- अपने सेल अब ऑप्टिकल imager में imaged किया जा करने के लिए तैयार हैं.
फ्लोरोसेंट रंजक भारतीय तट रक्षक के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लेबल
- मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए प्रक्रिया शुरू करने के लिए तैयार है, इसके विपरीत एजेंट ग्रीन Indocyanine. यह अभिकर्मक एजेंट Protamine के साथ मिक्स.
- Indocyanine ग्रीन पाउडर के बाहर 1mg उपाय. डाइमिथाइल Sulfoxide (DMSO) के 100 μL में भारतीय तट रक्षक पाउडर भंग.
- मिश्रण को Dulbecco संशोधित ईगल्स (DMEM सीरम + 10% भ्रूण बछड़ा) मध्यम मीडिया के 400 μL जोड़ें और यह अच्छी तरह हिला. 2mg/ml के अंतिम की एकाग्रता में यह परिणाम ग्रीन Indocyanine.
- अभिकर्मक एजेंट Protamine जोड़ें. विपरीत एजेंट के लिए एक शटल के रूप में Protamine कार्य करता है, इसलिए है कि यह सेल में और अधिक कुशलता से हो जाता है.
- 5 μL Protamine सल्फेट, जो 10mg/ml के एक एकाग्रता में आपूर्ति 300 μL भारतीय तट रक्षक और 300 μL सीरम मुक्त Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम के साथ मिक्स.
- धीरे से 5 मिनट के लिए नई अभिकर्मक समाधान हिला फार्म करने के लिए जटिल की अनुमति है.
- लेबलिंग समाधान के लिए तैयार है.
- HESC 10mm पेट्री डिश से बाहर पुराने मीडिया Aspirate.
- पूर्व गर्म सीरम मुक्त DMEM 5ml जोड़ें.
- पहले से तैयार Protamine / भारतीय तट रक्षक कोशिकाओं का हल जोड़ें. एक मशीन में 37 पर पकवान रखकर 1 घंटे ऊष्मायन प्रारंभ डिग्री सेल्सियस
- ऊष्मायन के बाद पूरा हो गया है, मशीन से पकवान हटाने और लेबलिंग समाधान aspirate.
- 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ पकवान rinsing द्वारा कोशिकाओं धो लें.
- बाहर पीबीएस Aspirate और 0.25% trypsin के 5ml के साथ बदलें. 37 पर पकवान सेते डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए trypsinization घटित करने के लिए अनुमति देते हैं. यह एक छोटे से हर एक बार थोड़ी देर में पकवान हिला करने में मदद करता है.
- धीरे विंदुक ऊपर और नीचे, शेष कालोनियों को तोड़ने.
- पकवान KSR के एक बराबर राशि जोड़कर trypsin बेअसर.
- एक 15ml ट्यूब सेल समाधान स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ पर समाधान अपकेंद्रित्र.
- पूरे मीडिया में कोशिकाओं Resuspend.
- अगर वहाँ अभी भी इस बिंदु पर clumps हैं trypsinize, और फिर अपकेंद्रित्र.
- एक बार एक पेड़ों का झुरमुट मुफ्त सेल समाधान हासिल की है, बाहर पुराने मीडिया aspirate और पूर्व गर्म पूर्ण ईएससी मीडिया के 10ml में गोली resuspend.
- इस बिंदु पर, यह hESCs से माउस फीडर कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है. यह है कि यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है, बाद में, केवल इमेजिंग स्टेम कोशिकाओं होता है.
- इस के लिए, वें हस्तांतरणई सेल जिलेटिन लेपित 10 सेमी पकवान समाधान.
- 37 ° सी इनक्यूबेटर में पकवान रखो और इसे 45 मिनट के लिए बैठते हैं. इस समय के दौरान, पकवान परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें. अब, भक्षण डिश के लिए पालन करना और स्टेम सेल नहीं होगा.
- पेट्री डिश से बाहर समाधान स्थानांतरण. और अब हम एक लेबल मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के एकल कक्षों का समाधान है.
- कोशिकाओं को अब और गिना जा सकता है एक Trypan नीले परीक्षण उन पर प्रदर्शन किया जा सकता है है है.
- कोशिकाओं imaged किया जा के लिए तैयार हैं!
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Discussion
पुराना एक अपेक्षाकृत नया इमेजिंग तकनीक है, प्रतिदीप्ति का पता लगाने पर आधारित है. पुराना radiotracer आधारित इमेजिंग तकनीक के रूप में के रूप में प्रति संवेदनशील है, लेकिन किसी भी विकिरण जोखिम के साथ संबद्ध नहीं है. पुराना ट्रैकिंग गैर invasively और repetitively कोशिकाओं का एक प्रभावी साधन प्रदान करता है, जिससे लक्षित साइट के लिए सेल प्रवास में अंतर्दृष्टि प्रदान. तकनीक का एक प्रमुख सीमा vivo में फ्लोरोसेंट जांच के सीमित ऊतक पैठ है. इस प्रकार, गहरी ऊतकों में एक ट्रेसर संचय, त्वचा की सतह से 5-10 सेमी के बारे में की तुलना में अधिक का पता लगाया नहीं किया जा सकता है. वर्तमान नैदानिक अनुप्रयोगों इंडोस्कोपिक, हृदय और retinae इमेजिंग (Funovics एट अल 2003.) के रूप में सतही तकनीकों को सीमित कर रहे हैं, लेकिन अनुसंधान के इस डोमेन के लिए विशाल vivo में सेल ट्रैकिंग में की पेशकश की संभावनाओं की मान्यता के माध्यम से विस्तार जारी रहेगा.
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Acknowledgments
यह परियोजना एक लियोन पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से जे थाल बीज अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. टोबीस हेनिंग एक जर्मन रिसर्च एसोसिएशन (DFG, महामहिम 4578/1-2) से वजीफा रिसर्च द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति पर अपनी सलाह के लिए आभार Juanito Meneses को स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
