Summary
이 동영상은 형광 염료와 인간 배아 줄기 세포 및 mesenchymal 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 기술은 광학 이미징과 이식 줄기 세포의 생체내 추적에와 형광 현미경과 histopathological 상관 관계에 대해 사용할 수 있습니다.
Abstract
광학 이미징 (오이)는 새로운 줄기 세포 기반 요법의 생체내 모니터링을 위해 쉽고, 빠르고 저렴한 도구입니다. 이 기술은 형광 염료, 특정 대상 기관 또는 pathologies들의 축적의 라벨 세포 및 시각화의 후속 정맥 주사와 함께 줄기 세포의 생체내 전 라벨에 따라 달라집니다. 제공 기술나요 (C67H103CIN2O3S)와 우리가 인간 배아의 줄기 세포를 (hESC) 라벨을 어떻게 FDA는 형광 염료가 그린 (ICG)을 Indocyanine 승인을 우리가 lipophilic 형광 염료와 함께 간단하게 부화하여 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)를 분류하는 방법을 보여줍니다. 이해 메커니즘은 인지질의 세포 막 이중층에 걸쳐 lypophilic 염료의 준수 및 확산을 통해이다. 세포와 같은 혈청 함유 미디어 부화 반대로 혈청없는 미디어의 염료와 incubated하는 경우 라벨의 효율은 일반적으로 향상됩니다. 또한, transfection 에이전트 프로타민 황산의 추가가 대비 에이전트 이해를 크게 향상시킵니다.
Protocol
형광 염료와 mesenchymal 줄기 세포의 라벨링 것은나요
- mesenchymal 줄기 세포를 라벨에 대한 절차를 시작하려면 trypsinize 및 세포의 정의된 번호를 중지를 얻을 수있는 세포를 계산합니다.
- 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 세포가 표시되는 포함된 flasks에서 이전 미디어를 기음
- MG / CA - 무료 PBS 10 ML있는 세포를 씻으십시오. PBS를 대기음. MG와 CA는 트립신을 억제 것이다 그러므로 우리는이없이는 PBS를 사용합니다.
- 우리가 5ml를 사용하여 T75 플라스크에 대한 사전 예열 0.05 %의 트립신을 추가합니다. 술병의 전체 표면이 적용되었는지 확인하십시오.
- 약 5 분 동안 37 ° C 배양기에서에 품어.
- 현미경으로 초연을 확인합니다. 세포가 계속 술병을 준수하면, 몇 번 누르고 trypsinization이 성공 때까지 조금 더 기다려.
- 이제 10 % FCS를 포함하는 미디어를 추가하여 트립신을 중화하는 것이 필요합니다. 트립신가로서 우리는 매체의 동일한 금액을 사용합니다.
- 모든 세포가 언론에 다시 중단되는 것을 보장하기 위해 몇 번 위아래로 피펫합니다.
- 멸균 15ml 덮인 폴리 프로필렌 튜브에 세포 솔루션을 전송합니다.
- 5 분 400 RCF에서 원심 분리기.
- 세포 펠렛을 방해하지 않도록 보장 뜨는을 대기음.
- DMEM에있는 세포를 Resuspend 및 세포 개수와 함께 진행합니다.
- 혈청이없는 배지 (DMEM)에 ML 당 ^ 6 1x10의 밀도에 표시되도록 세포를 일시 중지합니다.
- 이것은 세포 현탁액의 모든 준비했습니다. 지금, 그것은 상표를 시작할 준비가 된 것입니다.
- 첫째, 세포 현탁액의 ML 당나요 대비 에이전트의 5 μL를 추가합니다.
- 그런 다음, 부드럽게 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
- 37 라벨 솔루션 ° 6 - 잘 낮은 첨부 접시에 20 분 C와 세포를 품어.
- 간단한 배양이 완료되면, 그것은 15 ML 덮인 폴리 프로필렌 튜브에 세포 솔루션을 전송하는 것이 필요합니다.
- 5 분 400 RCF에서 내려 원심 분리기.
- 세포 펠렛을 방해하지 않도록 보장 라벨 매체를 대기음.
- PBS로 세포를 씻으십시오. 세포를 피펫 아래로, 세포 펠렛을 휴식해야하고.
- 후자의 두 단계 두 번 더 반복하므로 3 세척 단계 총 있습니다.
- 세포를 카운트하고 세포 생존을 결정하기 위해 Trypan 파랑 테스트를 수행합니다. 이것은 우리가 여기서 설명하지 않을 것을 표준 세포 배양 프로토콜입니다.
- 당신의 세포는 현재 광학 영상기에 몇 군데 준비하고 있습니다.
형광 염료의 ICG와 인간 배아 줄기 세포의 라벨링
- 인간 배아 줄기 세포를 라벨에 대한 절차를 시작하려면 대비 에이전트가 그린 Indocyanine 준비합니다. transfection 에이전트 프로타민와 함께 섞는다.
- Indocyanine 그린 파우더 1mg을 측정합니다. 디메틸 Sulfoxide (DMSO) 100 μL에 ICG 분말을 디졸브.
- 혼합물에 Dulbecco의 수정 이글스 중간 (DMEM + 10% 소태아 세럼) 미디어 400 μL를 추가하고 잘 흔들어. 의 2mg/ml의 최종 농도이 결과는 그린 Indocyanine.
- transfection 에이전트 프로타민를 추가합니다. 대비 에이전트 셔틀로 프로타민 행위, 그것이보다 효율적으로 세포에 도착 있도록.
- 300 μL ICG 300 μL 혈청 무료 Dulbecco의 수정 이글스 매체, 10mg/ml의 농도에서 제공하는 5 μL 프로타민 황산을 섞는다.
- 부드럽게 양식으로 복잡한 수 있도록 5 분 동안 새로운 transfection 솔루션을 흔들.
- 라벨 솔루션은 준비가 된 것입니다.
- hESC 10mm 페트리 접시에서 기존의 미디어를 대기음.
- 사전 예열 혈청없는 DMEM의 5ml를 추가합니다.
- 세포에 이전 준비 프로타민 / ICG 솔루션을 추가합니다. 37 인큐베이터에있는 접시를 배치하여 1 시간 보육을 시작 ° C.
- 배양이 완료되면, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 라벨 솔루션을 대기음.
- 5 ML PBS로 접시를 rinsing하여 세포를 씻으십시오.
- PBS를 기음과 0.25 %의 트립신의 5ml로 바꿉니다. ° C 5 분 trypsinization가 발생할 수 있도록 37 접시를 품어. 그것은 한동안 조금 매번 접시를 흔들 수 있도록 도와줍니다.
- 부드럽게 남아있는 식민지를 깨고, 아래로 피펫합니다.
- 접시에 KSR의 동일한 금액을 추가하여 트립신을 중화.
- 15ml 튜브에 세포 솔루션을 전송 5 분 400 RCF에서 솔루션을 원심 분리기.
- 전체 미디어 세포를 Resuspend.
- 지금이 시점에서 대단히 짧은 시간이있다면, trypsinize 다시 원심 분리기.
- 덩어리가없는 세포 솔루션 달성되면, 기존의 미디어를 기음과 미리 예열 전체 ESC 미디어의 10ml의 펠렛을 resuspend.
- 이 시점에서, 그것은 hESCs에서 마우스 피더 세포를 분리하는 것이 필요합니다. 이것은 그것을 보장하기 위해 수행, 나중에, 오직 영상 줄기 세포가 발생합니다.
- 이를 위해 일을 전송할젤라틴 코팅 10cm 접시에 전자 전지 솔루션입니다.
- 37 ° C 배양기에 접시를 넣어 45 분 동안 앉아 보자. 이 시간 동안 접시를 방해하지 않도록하십시오. 자, 피더는 음식을 준수하고 줄기 세포는하지 않습니다.
- 페트리 접시 밖으로 솔루션을 전송합니다. 지금 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 표시 단일 세포의 해결책을 가지고 있습니다.
- 세포는 현재 계산 수 있으며 Trypan 파랑 시험은 그들을 수행할 수 있습니다.
- 세포가 몇 군데 준비 있습니다!
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Discussion
오이는 형광의 감지에 따라 비교적 새로운 이미징 기술입니다. 오이는 radiotracer 기반 이미징 기술을 같이 구분하지만, 모든 방사선 노출과 관련되지 않았습니다. 오이는이를 대상 사이트에 셀 마이 그 레이션에 대한 통찰력을 제공하는 비 invasively하고 반복적으로 추적 세포의 효과적인 수단을 제공합니다. 기술 중 하나는 주요 제한은 생체내에 형광 프로브의 제한된 조직 침투입니다. 따라서 피부 표면 5-10cm에 대한보다 깊은 조직의 추적 축적은, 감지되지 않을 수도 있습니다. 현재 임상 응용 프로그램 등, 내시경 심혈관 및 retinae 이미징 (Funovics 외. 2003)로 표면 기술로 제한되어 있습니다하지만, 연구의 도메인 생체내 세포 추적에 의해 제공하는 거대한 가능성의 인식을 통해 확장하는 것입니다.
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Acknowledgments
이 프로젝트는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소에서 레온 J. Thal 시드 부여에 의해 지원되었다. 토바 이어스 헤닝는 독일 연구 협회 (DFG, HE 4578/1-2)에서 급비 연구에 의해 투자되었다. 우리는 기꺼이 그 인간의 배아 줄기 세포의 문화에 대한 그의 조언 후아의 Meneses을 인정 싶어요.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
