Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Summary

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Abstract

Optical Imaging (OI) ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Werkzeug zur In-vivo-Überwachung der neuen Stammzell-basierten Therapien. Die Technik basiert auf ex vivo-Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff, anschließende intravenöse Injektion der markierten Zellen und Visualisierung ihrer Anreicherung in bestimmten Zielorganen oder Pathologien basiert. Die vorgestellte Technik zeigt, wie wir von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) Etikett durch einfache Inkubation mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff DiD (C67H103CIN2O3S) und wie wir humanen embryonalen Stammzellen (hES) Etikett mit der FDA zugelassen Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün (ICG). Die Aufnahme-Mechanismus erfolgt über die Einhaltung und Verbreitung der lipophilen Farbstoff in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel verbessert werden, wenn die Zellen mit dem Farbstoff in serum-freien Medien als der Inkubation in Serum-haltigen Medien Gegensatz bebrütet werden. Darüber hinaus ist der Zusatz des Transfektionsagens Protaminsulfat deutlich verbessert Kontrastmittelaufnahme.

Protocol

Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff DiD

1. Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung mesenchymale Stammzellen, trypsinize und zählen Sie die Zellen, um eine Suspension mit einer definierten Anzahl von Zellen erhalten.
2. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen aus alten Medien von den Flaschen mit den Zellen markiert werden
3. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml Mg / Ca-freiem PBS. Saugen Sie die PBS. Die Mg-und Ca würde hemmen die Trypsin, deshalb verwenden wir PBS ohne diese.
4. Add vorgewärmten 0,05% Trypsin, für eine T75-Kolben verwenden wir 5ml. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche des Kolbens bedeckt ist.
5. Bei 37 ° C im Brutschrank für ca. 5 Minuten.
6. Bestätigen Sie die Ablösung unter dem Mikroskop. Wenn die Zellen noch in den Kolben halten, tippen Sie es ein paar Mal und warten Sie ein wenig länger, bis die Trypsinierung erfolgreich ist.
7. Nun ist es notwendig, die Trypsin durch Zugabe von Medium mit 10% FCS zu neutralisieren. Wir verwenden die gleiche Menge von Medien, da es Trypsin.
8. Pipette nach oben und unten ein paar Mal, um sicherzustellen, dass alle Zellen in den Medien erneut suspendiert.
9. Übertragen Sie die Zell-Lösung zu einer sterilen 15ml capped Polypropylenröhrchen.
10. Zentrifuge bei 400 rcf für 5 Minuten.
11. Absaugen aus dem Überstand die Gewährleistung nicht auf das Zellpellet zu stören.
12. Resuspendieren der Zellen in DMEM und fahren Sie mit der Zellzahl.
13. Suspend die Zellen bei einer Dichte von 1x10 gekennzeichnet sein ^ 6 pro ml in serumfreiem Kulturmedium (DMEM).
14. Das war alles Vorbereitung der Zellsuspension. Nun ist es bereit, die Kennzeichnung zu starten.
15. Fügen Sie zuerst 5 ul DiD Kontrastmittel pro ml Zellsuspension.
16. Dann mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren.
17. Inkubieren Sie die Zellen mit der Beschriftung Lösung bei 37 ° C für 20 Minuten in einer 6-well low-Anlage Gericht.
18. Sobald die einfache Inkubation abgeschlossen ist, ist es notwendig, die Zell-Lösung in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen verschlossen zu übertragen.
19. Centrifuge es sich bei 400 rcf für 5 Minuten.
20. Saugen Sie die Kennzeichnung Medium, wodurch nicht Zellpellet stören.
21. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Pipette die Zellen auf und ab, und achten Sie darauf brechen die Zellpellet.
22. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte noch zwei weitere Male, so dass es insgesamt 3 Waschschritte.
23. Zählen Sie die Zellen und führen Sie eine Trypanblau-Test, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Dies sind Standard-Zellkultur-Protokolle, dass wir nicht hier zu erklären.
24. Ihre Zellen sind nun bereit, in der optischen Imager abgebildet werden.

Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff ICG

1. Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung menschlicher embryonaler Stammzellen, bereiten das Kontrastmittel Indocyaningrün. Mischen Sie es mit der Transfektionsagens Protamin.
2. Messen Sie 1mg der Indocyaningrün Pulver. Lösen Sie die ICG-Pulver in 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO).
3. Add 400 ul Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM + 10% fötales Kälberserum) Medien auf die Mischung und schütteln Sie sie gut. Dies führt zu einer finalen Konzentration von 2mg/ml von Indocyaningrün.
4. Fügen Sie die Transfektionsagens Protamin. Protamin fungiert als Shuttle für das Kontrastmittel, so dass es in die Zelle wird effizienter.
5. Mix 5 ul Protaminsulfat, die bei einer Konzentration von 10mg/ml geliefert wird, mit 300 ul ICG und 300 ul serumfreiem Dulbeccos Modified Eagles Medium.
6. Schütteln Sie die neue Transfektion Lösung für 5 Minuten, damit komplexe zu bilden.
7. Die Kennzeichnung Lösung bereit ist.
8. Saugen Sie die alten Medien von hES-10mm Petrischale.
9. Add 5 ml vorgewärmten serumfreien DMEM.
10. Fügen Sie die zuvor vorbereiteten Protamin / ICG-Lösung zu den Zellen. Starten Sie die 1 Stunde Inkubation, indem das Gericht in einem Brutschrank bei 37 ° C.
11. Nach der Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Schale aus dem Inkubator und saugen die Kennzeichnung Lösung.
12. Waschen Sie die Zellen durch Spülen der Teller mit 5 ml PBS.
13. Saugen Sie die PBS und ersetzen mit 5 ml 0,25% Trypsin. Inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C für 5 Minuten, damit Trypsinierung auftreten. Es hilft, die Schüssel ein wenig hin und wieder schütteln in eine Weile.
14. Gently Pipette auf und ab, brechen die restlichen Kolonien.
15. Neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe einer gleichen Menge von KSR, die Schüssel.
16. Übertragen Sie die Zelle Lösung für ein 15ml Tube und zentrifugieren die Lösung bei 400 rcf für 5 Minuten.
17. Resuspendieren der Zellen in voller Medien.
18. Wenn es noch Klumpen an dieser Stelle sind, trypsinize und Zentrifuge wieder.
19. Sobald ein Klumpen-freie Zelle Lösung erreicht wird, saugen aus den alten Medien und das Pellet in 10 ml vorgewärmten volle ESC-Medien.
20. An dieser Stelle ist es notwendig, die Maus Feeder-Zellen aus dem hESCs trennen. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass später, tritt nur die Abbildung der Stammzellen.
21. Dazu übertragen the Zelle Lösung eines Gelatine beschichtete 10 cm Schüssel.
22. Setzen Sie die Schüssel in die 37 ° C Inkubator und lassen Sie ihn 45 Minuten lang sitzen. Während dieser Zeit, stellen Sie sicher nicht auf den Teller zu stören. Nun werden die Anleger, die Schüssel halten und die Stammzellen nicht.
23. Übertragen Sie die Lösung aus der Petrischale. und jetzt haben wir einen markierten Einzelzellen Lösung von menschlichen embryonalen Stammzellen.
24. Die Zellen können nun gezählt werden und eine Trypanblau-Test kann an ihnen durchgeführt werden.
25. Die Zellen sind bereit, die abgebildet werden!

Discussion

OI ist ein relativ neues bildgebendes Verfahren, basierend auf der Detektion von Fluoreszenz. OI ist so sensibel wie Radiotracer-basierten Imaging-Techniken, aber nicht mit einer Bestrahlung Exposition verbunden. OI stellt ein wirksames Mittel zur Verfolgung Zellen nicht-invasiv und wiederholt damit einen Einblick in die Zellwanderung an den Zielort. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die begrenzte Eindringen in das Gewebe von fluoreszierenden Sonden in vivo. So ein Tracer Akkumulation im tiefen Gewebe, mehr als etwa 5-10 cm von der Hautoberfläche, kann nicht erkannt werden. Aktuelle klinische Anwendungen sind oberflächliche Techniken wie endoskopische, Herz-Kreislauf-und retinae Bildgebung (Funovics et al. 2003) beschränkt, sondern dieser Bereich der Forschung wird auch weiterhin durch die Anerkennung der großen Möglichkeiten, die durch in vivo Zell-Tracking erweitern.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Biosciences	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners