Summary
Это видео показывает методы маркировки человеческих эмбриональных стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток с флуоресцентными красителями. Эта техника может быть использована для отслеживания в естественных условиях трансплантированных стволовых клеток с оптических изображений и гистопатологические корреляции с флуоресцентной микроскопии.
Abstract
Оптическая томография (OI) это простой, быстрый и недорогой инструмент для прижизненного мониторинга новых стволовых клеток терапий. Методика основана на бывших маркировки естественных условиях из стволовых клеток с флуоресцентным красителем, последующее внутривенное введение меченых клеток и визуализации их накопление в определенных органах-мишенях или патологий. Представлена методика демонстрирует, как мы называем мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSC) простым инкубации с липофильных флуоресцентного красителя DID (C67H103CIN2O3S) и как мы называем человека стволовых эмбриональных клеток (чЭСК) с FDA утвержденных флуоресцентного красителя индоцианина зеленого (МКГ). Поглощение через механизм соблюдения и распространение lypophilic красителя на мембране ячейки бислоя фосфолипидов. Маркировки эффективности, как правило, лучше, если клетки инкубировали с красителем в бессывороточной СМИ, в отличие от инкубации в сыворотке средах. Кроме того, добавление протамина сульфат агентом трансфекции значительно улучшает поглощение контрастного вещества.
Protocol
Маркировка мезенхимальных стволовых клеток с флуоресцентным красителем DiD
- Чтобы начать процедуру маркировки мезенхимальные стволовые клетки, trypsinize и посчитать клетки, чтобы получить подвеску с определенного количества клеток.
- Возьмите клеток из инкубатора и аспирата из старых средств массовой информации из колбы, содержащие ячейки, которые будут помечены
- Вымойте клеток с 10 мл Mg / Ca без PBS. Аспирацию из ФСБ. Mg и Са будет препятствовать трипсина, поэтому мы используем ФСБ без них.
- Добавить подогретого 0,05% трипсина, для T75 колбе мы используем 5 мл. Убедитесь, что вся поверхность колбы покрыта.
- Инкубировать при 37 ° C в инкубаторе в течение приблизительно 5 минут.
- Подтвердите отряд под микроскопом. Если клетки, до сих пор придерживаются колбу, нажмите на него несколько раз и немного подождать, пока трипсинизации успешно.
- Теперь, необходимо, чтобы нейтрализовать трипсина путем добавления среде, содержащей 10% FCS. Мы используем одинаковое количество средств массовой информации, поскольку есть трипсина.
- Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что все клетки ресуспендировали в средствах массовой информации.
- Передача клетка решение стерильные 15 мл ограничен труба полипропилен.
- Центрифуга при 400 RCF течение 5 минут.
- Аспирацию из надосадочной обеспечения, чтобы не нарушить клеточный осадок.
- Ресуспендируют клеток в DMEM и продолжить клеток.
- Приостановить ячейки, которые будут помечены на плотность 1x10 ^ 6 на мл в свободной от сыворотки культуральной среде (DMEM).
- Все это было подготовкой клеточной суспензии. Теперь он готов приступить к маркировке.
- Во-первых, добавить 5 мкл DiD контрастного вещества на мл клеточной суспензии.
- Затем, смешайте решение, осторожно пипеткой.
- Инкубируйте клетки с маркировки раствора при температуре 37 ° С в течение 20 минут в 6-и низко-привязанность блюдо.
- После простой инкубации завершена, необходимо передать ячейку решение 15 мл ограничен труба полипропилен.
- Центрифуга его вниз на 400 RCF течение 5 минут.
- Аспирацию из маркировки среды, обеспечение не мешать осадок клеток.
- Вымойте клеток с PBS. Внесите клетки вверх и вниз, убедившись, что для разгона осадок клеток.
- Повторите два последних шага еще два раза, так что в общей сложности 3 этапов промывки.
- Граф клетки и осуществляют Трипановый синий тест для определения жизнеспособности клеток. Это стандартные культуре клеток протоколов, которые мы не собираемся объяснять здесь.
- Ваши клетки теперь готовы для включения в образ в оптических изображений.
Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток с флуоресцентным красителем МКГ
- Чтобы начать процедуру маркировки человеческих эмбриональных стволовых клеток, готовят контрастного вещества индоцианина Грин. Смешайте его с протамина агентом трансфекции.
- Отмерьте 1 мг индоцианина зеленого порошка. Растворите порошок в МКГ по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
- Добавить 400 мкл модифицированного орлы Дульбеко Средняя (DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки) средств массовой информации к смеси и встряхните ее хорошо. Это приводит к конечной концентрации 2mg/ml из индоцианина Грин.
- Добавить Протамина трансфекции агента. Протамина действует как челнок для контрастного вещества, так что она попадает в ячейку более эффективно.
- Смешайте 5 мкл протамина сульфат, который поставляется в концентрации 10mg/ml, с 300 мкл МКГ и 300 мкл изменения бессывороточной Дульбеко орлы Средний.
- Осторожно встряхните новое решение трансфекции в течение 5 минут, чтобы дать сложно форме.
- Маркировки решение готово.
- Аспирацию из старых средств массовой информации из чЭСК блюдо 10мм Петри.
- Добавить 5 мл подогретого бессывороточной DMEM.
- Добавить заранее подготовленные Протамина / МКГ решение клеток. Начало 1 час инкубации, поставив блюдо в инкубаторе при температуре 37 ° C.
- После инкубации завершено, удалить блюдо из инкубатора и аспирата из маркировки решение.
- Вымойте клетки путем промывки блюдо с 5 мл PBS.
- Аспирацию из PBS и заменить 5 мл 0,25% трипсина. Инкубируйте блюдо при температуре 37 ° С в течение 5 минут, чтобы дать трипсинизации произойти. Она помогает избавиться блюда понемногу каждый раз в то время.
- Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы разбить оставшиеся колонии.
- Нейтрализовать трипсина путем добавления равное количество KSR на блюдо.
- Передача клетка решение 15мл трубки и центрифуги решение при 400 RCF течение 5 минут.
- Ресуспендируют клетки в полном объеме средства массовой информации.
- Если еще есть сгустки в этой точке, trypsinize и центрифуга снова.
- Как только комок решение без ячейки достигнута, аспирата из старых СМИ и ресуспендируют осадок в 10 мл подогретого полный СМИ ESC.
- На данный момент, необходимо отделить мыши фидерных клеток из ЭСК. Это делается для обеспечения того, позже, только изображения стволовых клеток происходит.
- Для этого, передача гоэлектронная ячейка решение желатин покрытием 10 см блюдо.
- Поставьте блюдо в 37 ° С инкубатор и оставьте на 45 минут. В течение этого времени, убедитесь, не мешать блюдо. Теперь, питатели будет придерживаться блюдо и стволовые клетки не будут.
- Перенесите раствор из чашки Петри. и теперь мы имеем помечены единое решение клетки человеческих эмбриональных стволовых клеток.
- Клетки теперь могут быть посчитаны и тест Трипановый синий могут быть выполнены на них.
- Клетки готовы для включения в образ!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
О. И. представляет собой относительно новую технику обработки изображений, основанный на обнаружении флуоресценции. О. И. столь же чувствительны, как радиоактивный индикатор основе методов визуализации, но не связан ни с облучением экспозиции. О. И. предоставляет эффективные средства отслеживания клетки неинвазивно и многократно, тем самым обеспечивая понимание миграции клеток на целевой сайт. Одним из основных ограничений техника ограниченное проникновение ткани флуоресцентных зондов в естественных условиях. Таким образом, накопление примеси в глубоких тканях, более чем на 5-10 см от поверхности кожи, не может быть обнаружена. Текущий клиническое применение ограничивается поверхностным методы, такие как эндоскопические, сердечно-сосудистой и сетчатки томография (Funovics и соавт. 2003), но эта область исследований будет продолжать расширяться за счет признания огромных возможностей, предлагаемых в естественных условиях отслеживания клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан Леон Дж. Тал грант SEED Калифорнийского института регенеративной медицины. Тобиас Хеннинг было профинансировано исследований стипендию от немецкого исследовательская ассоциация (DFG, Его 4578/1-2). Мы хотим выразить искреннюю признательность Хуанито Менесес за его советы по культуре эмбриональных стволовых клеток человека.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
