Summary
Bu video floresan boya ile insan embriyonik kök hücreler ve mezenkimal kök hücreler etiketleme teknikleri gösterir. Bu teknik, in vivo olarak bir optik görüntüleme ile nakledilen kök hücrelerin izleme ve floresan mikroskobu ile histopatolojik korelasyon kullanılabilir.
Abstract
Optik görüntüleme (OI), yeni kök hücre tabanlı tedaviler in vivo olarak izlenmesi için kolay, hızlı ve ucuz bir araçtır. Teknik floresan boya etiketli hücreleri belirli hedef organları veya patolojiler kendi birikimi ve görselleştirme sonraki intravenöz enjeksiyon ile kök hücrelerinin ex vivo etiketleme dayanmaktadır. Sunulan tekniği (C67H103CIN2O3S) ve biz insan embriyonik kök hücreleri (hESC) etiket nasıl FDA floresan boya İndosiyanin Yeşil (ICG) onaylı lipofilik floresan boya ile basit inkübasyon insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC) etiket nasıl gösterir. Fosfolipid hücre zarı bilayeri genelinde lypophilic boya bağlılık ve difüzyon yoluyla alımı mekanizması. Hücreler serum içeren medya inkübasyon karşı serum serbest medya boya ile inkübe edilir etiketleme verimliliği artırıldı. Ayrıca, transfeksiyon ajan Protamin Sülfat ek kontrast madde alımını önemli ölçüde artırır.
Protocol
Floresan boya ile mezenkimal kök hücrelerin Etiketleme DID
- Mezenkimal kök hücreleri etiketleme prosedürü başlatmak için, trypsinize ve hücrelerin belirli bir sayı ile bir süspansiyon elde etmek için hücre sayımı.
- Kuluçka hücreleri ve etiketli hücreleri içeren şişeler eski medya aspirat
- Mg / Ca-free PBS 10 ml hücreleri yıkayın. PBS aspire. Mg ve Ca tripsin inhibe eder, bu nedenle biz bu olmadan PBS kullanabilirsiniz.
- 5ml kullanan T75 şişesi için, önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin ekleyin. Balonun tüm yüzeyi kaplı olduğundan emin olun.
- Yaklaşık 5 dakika için 37 ° C inkübatör 'da inkübe edin.
- Mikroskop altında dekolmanı onaylayın. Hücreleri hala balona bağlı ise, birkaç kez dokunun ve trypsinization başarılı oluncaya kadar biraz daha bekleyin.
- Şimdi,% 10 FCS içeren medya ekleyerek tripsin nötralize etmek için gerekli. Tripsin var olduğu gibi bir ortam eşit miktarda kullanın.
- Olduğunu tüm hücreleri medyada tekrar askıya sağlamak için birkaç kez aşağı yukarı Pipet.
- Hücre çözümü 15ml steril kapaklı polipropilen tüp aktarın.
- 5 dakika boyunca 400 RCF santrifüjleyin.
- Hücre pelletini rahatsız etmeyecek şekilde sağlanması süpernatantı aspire.
- DMEM hücrelerin yeniden süspanse edin ve hücre sayımı ile devam edin.
- ^ 6 ml serum serbest kültür vasatı (DMEM) başına 1x10 yoğunluğu etiketlenmesine hücreleri askıya alınması.
- Bu hücre süspansiyonu tüm hazırlık oldu. Şimdi, etiketleme başlamak için hazır.
- İlk olarak, hücre süspansiyonu ml başına kontrast madde 5 mcL ekleyin.
- Sonra, yavaşça pipetleme çözüm karıştırın.
- Etiketleme çözümü 37 ° C de 20 dakika 6-iyi bir düşük-attachment çanak hücreleri inkübe edin.
- Basit inkübasyon tamamlandıktan sonra, 15 ml kapaklı polipropilen tüp hücre çözümü aktarmak için gereklidir.
- 5 dakika boyunca 400 RCF santrifüjleyin.
- Hücre pelletini rahatsız sağlanması, etiketleme orta aspire edin.
- Hücreler PBS ile yıkayın. Hücreler yukarı ve aşağı Pipet, hücre pelletini break up emin olun.
- Son iki adımı iki kez daha tekrarlayın, bu nedenle bir toplam 3 yıkama adımları var.
- Hücre sayımı ve hücre canlılığını belirlemek için bir Tripan mavi testi gerçekleştirin. Bunlar, standart hücre kültürü protokolleri burada anlatmayacağım olduğunu.
- Hücreler artık optik görüntüleyici görüntülü hazır.
Floresan boya ICG ile insan embriyonik kök hücreleri Etiketleme
- Insan embriyonik kök hücreleri etiketleme prosedürü başlatmak için, kontrast madde Yeşil İndosiyanin hazırlamak. Transfeksiyon ajan Protamin ile karıştırın.
- İndosiyanin Yeşil toz 1mg ölçün. Dimetil sülfoksit (DMSO) 100 mcL ICG tozu çözülür.
- Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM +% 10 Fötal Buzağı Serumu) medya 400 mcL karışıma ekleyin ve iyice sallayın. Bu sonuç, 2mg/ml son bir konsantrasyon Yeşil İndosiyanin.
- Transfeksiyon ajan Protamin ekleyin. Kontrast madde için bir servis olarak protamin eylemler, bu nedenle daha verimli bir şekilde hücre içine alır.
- 300 mcL ICG ve 300 mcL serum serbest Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta 10mg/ml bir konsantrasyon sağlanır 5 mcL protamin sülfat, karıştırın.
- Formu karmaşık izin vermek için 5 dakika için yeni transfeksiyon çözüm yavaşça sallayın.
- Etiketleme çözümü hazırdır.
- HESC 10mm Petri kabı eski medya aspire.
- Önceden ısıtılmış serum serbest DMEM 5ml ekle.
- Hücreleri için önceden hazırlanmış Protamin / ICG solüsyonu ekleyin. 37 bir kuluçka makinesi, bulaşık koyarak 1 saat inkübasyon Başlat ° C
- Inkübasyon tamamlandıktan sonra, inkübatör çanak kaldırmak ve etiketleme çözümü aspirat.
- 5 ml PBS ile bulaşık durulama hücrelerin yıkayın.
- PBS aspire ve% 0.25 tripsin, 5ml ile değiştirin. 37 ° C'de 5 dakika trypsinization meydana izin çanak inkübe edin. Bu biraz her seferinde bir süre içinde çanak sallamak için yardımcı olur.
- Yavaşça kalan koloniler break up, pipet ve aşağı yukarı.
- KSR bir eşit miktarda çanak ekleyerek tripsin nötralize.
- 15ml tüp hücre çözümü aktarın ve 5 dakika boyunca 400 RCF çözüm santrifüj.
- Tam medya hücrelerin yeniden süspanse edin.
- Hala bu noktada az kümeleri varsa, trypsinize ve tekrar santrifüj.
- Bir tutam ücretsiz cep çözüm elde edildikten sonra, eski medya aspirat ve önceden ısıtılmış tam ESC medya 10ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- Bu noktada, hESC fare besleyici hücrelerini ayırmak için gereklidir. Bu emin olmak için yapılır, daha sonra, sadece görüntüleme kök hücreler oluşur.
- Bunun için, inci transferijelatin kaplı 10 cm çanak e hücre çözümü.
- Çanak 37 ° C inkübatör içine koyun ve 45 dakika bekletin. Bu süre zarfında, çanak rahatsız emin olun. Şimdi, çanak besleyiciler uyacaktır ve kök hücrelerin olmaz.
- Petri kabı çözüm dışarı aktarın. ve şimdi insan embriyonik kök hücre etiketli bir tek hücre çözümü var.
- Hücreleri sayılabilir ve Tripan mavi test yapılabilir.
- Hücreleri yansıması için hazırız!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI floresan algılama göre, görece yeni bir görüntüleme tekniğidir. OI radyotracer tabanlı görüntüleme teknikleri gibi hassas, ancak herhangi bir ışınlama maruz kalma ile ilişkili değildir. OI, böylece hedef site hücre göçü içgörü sağlayan non-invazif ve tekrarlayan izleme hücreleri etkili bir araç sağlar. Tekniğin önemli bir sınırlama in vivo floresan probları sınırlı doku penetrasyonu. Böylece, cilt yüzeyinden 5-10 cm daha derin dokularda bir izleme birikimi, tespit olmayabilir. Mevcut klinik uygulamalar, endoskopik, kardiyovasküler ve retinae görüntüleme (Funovics ve ark 2003) gibi yüzeysel teknikleri sınırlıdır ancak bu araştırma alanı, in vivo hücre izleme tarafından sunulan geniş olanaklar tanınması yoluyla genişletmeye devam edeceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu proje için California Rejeneratif Tıp Enstitüsü bir Leon J. Thal TOHUM hibe ile desteklendi. Tobias Henning, Alman Araştırma Birliği (DFG, HE 4578/1-2) nakit Araştırma tarafından finanse edildi. Biz insan embriyonik kök hücre kültürü onun tavsiye Juanito Meneses minnetle kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
