Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Summary

Questo video mostra le tecniche per l'etichettatura delle cellule staminali embrionali umane e cellule staminali mesenchimali con coloranti fluorescenti. Questa tecnica può essere utilizzata per un monitoraggio in vivo di cellule staminali trapiantate con imaging ottico e per le correlazioni istopatologiche con microscopia a fluorescenza.

Abstract

L'imaging ottico (OI) è uno strumento facile, veloce ed economico per il monitoraggio in vivo di nuove terapie basate sulle cellule staminali. La tecnica si basa sulla etichettatura ex vivo di cellule staminali con un colorante fluorescente, a seguito di iniezione endovenosa di cellule etichettate e la visualizzazione dei loro accumulo in organi bersaglio specifici o patologie. La tecnica è una dimostrazione il modo in cui l'etichetta cellule staminali mesenchimali (hMSC) semplice da incubazione con il colorante fluorescente lipofili DiD (C67H103CIN2O3S) e come etichetta cellule staminali embrionali umane (hESC) con la FDA ha approvato colorante fluorescente verde indocianina (ICG). Il meccanismo di assorbimento è attraverso l'aderenza e la diffusione del colorante lypophilic attraverso il doppio strato di fosfolipidi di membrana delle cellule. L'efficienza di etichettatura di solito è migliorata se le cellule sono incubate con il colorante nel siero privo di mezzi di comunicazione invece di incubazione nel siero contenenti media. Inoltre, l'aggiunta del solfato di protamina trasfezione agente migliora sensibilmente l'assorbimento agente di contrasto.

Protocol

Etichettatura delle cellule staminali mesenchimali con il colorante fluorescente DiD

1. Per iniziare la procedura per l'etichettatura di cellule staminali mesenchimali, trypsinize e contare le cellule per ottenere una sospensione con un numero definito di cellule.
2. Prendete le cellule fuori dell'incubatore ed aspirare i vecchi media dai recipienti contenenti le cellule da etichettare
3. Lavare le cellule con 10 ml di Mg / Ca-free PBS. Aspirare il PBS. La Mg e Ca inibirebbe la tripsina, quindi usiamo PBS senza questi.
4. Aggiungi preriscaldata tripsina 0,05%, per un pallone T75 si usa 5ml. Garantire che l'intera superficie del pallone è coperto.
5. Incubare a 37 ° C in incubatrice per circa 5 minuti.
6. Confermare il distacco sotto il microscopio. Se le cellule ancora aderire al pallone, che tocca un paio di volte e aspettare un po 'di più fino a quando il tripsinizzazione va a buon fine.
7. Ora, è necessario per neutralizzare l'tripsina con l'aggiunta di supporti contenenti il ​​10% FCS. Noi usiamo una pari quantità di mezzi di comunicazione in quanto vi è tripsina.
8. Pipetta su e giù per un paio di volte a garantire che tutte le cellule sono risospese nei media.
9. Trasferire la soluzione di cella a un tubo 15ml sterile in polipropilene con cappuccio.
10. Centrifugare a 400 rcf per 5 minuti.
11. Aspirare il sopranatante assicurando di non disturbare il pellet.
12. Risospendere le cellule in DMEM e procedere con la conta delle cellule.
13. Sospendere le cellule a essere etichettato con una densità di 1x10 ^ 6 per ml nel siero senza terreno di coltura (DMEM).
14. Questo era tutto preparazione della sospensione cellulare. Ora, è pronto per iniziare l'etichettatura.
15. In primo luogo, aggiungere 5 ml di mezzo di contrasto DiD per ml di sospensione cellulare.
16. Poi, mescolare la soluzione pipettando gentilmente.
17. Incubare le cellule con la soluzione di etichettatura a 37 ° C per 20 minuti in un 6-ben poco attaccamento piatto.
18. Una volta che l'incubazione semplice è completa, è necessario trasferire la soluzione di cellule in una provetta da 15 ml con tappo in polipropilene.
19. Centrifuga verso il basso a 400 rcf per 5 minuti.
20. Aspirare il medium etichettatura, assicurando di non disturbare il pellet.
21. Lavare le cellule con PBS. Pipettare le cellule su e giù, facendo attenzione a rompere il pellet.
22. Ripetere gli ultimi due passi due volte, quindi c'è un totale di 3 fasi di lavaggio.
23. Contare le celle ed eseguire un test Blu tripano per determinare la vitalità cellulare. Questi sono i protocolli standard di coltura cellulare che non stiamo andando a spiegare qui.
24. Le vostre cellule sono ora pronti per essere ripreso in imager ottica.

Etichettatura delle cellule staminali embrionali umane con il colorante fluorescente ICG

1. Per iniziare la procedura per l'etichettatura di cellule staminali embrionali umane, preparare il mezzo di contrasto verde indocianina. Mescolare con il Protamina agente di trasfezione.
2. Misurare 1mg di polvere verde indocianina. Sciogliere la polvere ICG in 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO).
3. Aggiungere 400 ml di Dulbecco modificato (DMEM + 10% Fetal Calf Serum), media per l'impasto e agitare bene. Ciò si traduce in una concentrazione finale di 2mg/ml del verde indocianina.
4. Aggiungere il protamina agente di trasfezione. Atti protamina come un servizio navetta per il mezzo di contrasto, in modo che entra nella cellula in modo più efficiente.
5. Mescolare 5 microlitri protamina solfato, che viene fornito ad una concentrazione di 10mg/ml, con 300 microlitri ICG e 300 ml di siero libero Dulbecco Modified Media Eagles.
6. Agitare delicatamente la nuova soluzione di trasfezione per 5 minuti per consentire di formare complessi.
7. La soluzione di etichettatura è pronto.
8. Aspirare i vecchi media da 10 millimetri piatto hESC Petri.
9. Aggiungere 5 ml di pre-riscaldato DMEM senza siero.
10. Aggiungere la soluzione precedentemente preparata Protamina / ICG alle cellule. Avviare l'incubazione 1 ora di mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C.
11. Dopo l'incubazione, rimuovere il piatto dal termostato ed aspirare la soluzione di etichettatura.
12. Lavare le cellule con il risciacquo il piatto con 5 ml di PBS.
13. Aspirare il PBS e sostituirlo con 5 ml di tripsina 0,25%. Incubare il piatto a 37 ° C per 5 minuti per consentire tripsinizzazione a verificarsi. Aiuta a scuotere il piatto un po 'ogni tanto un po'.
14. Pipettare delicatamente su e giù, per rompere le colonie rimanenti.
15. Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta di una quantità uguale di KSR al piatto.
16. Trasferire la soluzione di cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare la soluzione a 400 rcf per 5 minuti.
17. Risospendere le cellule in mezzi di comunicazione completo.
18. Se ci sono ancora aggregati a questo punto, trypsinize e centrifugare di nuovo.
19. Una volta che un gruppo senza soluzione di cella è raggiunto, aspirare i vecchi media e risospendere il pellet in 10ml di media piena pre-riscaldato ESC.
20. A questo punto, è necessario separare le cellule di alimentazione del mouse dal hESC. Questo viene fatto per garantire che, in seguito, solo le immagini delle cellule staminali avviene.
21. Per questo, il trasferimento °e soluzione di cella a una gelatina rivestito piatto 10 cm.
22. Mettere il piatto nel 37 ° C incubatore e lasciare riposare per 45 minuti. Durante questo tempo, fare attenzione a non disturbare il piatto. Ora, gli alimentatori aderirà al piatto e le cellule staminali non lo faranno.
23. Trasferire la soluzione fuori della scatola di Petri. e ora abbiamo una etichetta singola soluzione cellule di cellule staminali embrionali umane.
24. Le celle possono essere contati e un test Blu tripano può essere eseguito su di loro.
25. Le cellule sono pronte per essere ripreso!

Discussion

OI è una relativamente nuova tecnica di imaging, basato sul rilevamento di fluorescenza. OI è sensibile come radiofarmaco a base di tecniche di imaging, ma non associato ad alcuna esposizione irradiazione. OI fornisce un mezzo efficace di cellule monitoraggio non invasivo e ripetitivo, quindi permettono di approfondire la migrazione delle cellule al sito di destinazione. Una limitazione importante di questa tecnica è la penetrazione nei tessuti limitato di sonde fluorescenti in vivo. Così, un accumulo di tracciante nei tessuti profondi, più di circa 5-10 cm dalla superficie della pelle, non può essere rilevato. Attuali applicazioni cliniche sono limitate alle tecniche superficiali come endoscopica, cardiovascolari e retina di imaging (Funovics et al. 2003), ma questo dominio di ricerca continuerà ad espandersi attraverso il riconoscimento delle vaste possibilità offerte dal monitoraggio in cellule in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Biosciences	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners