与非侵入性检测荧光染料标记的干细胞与光学成像

Summary

该视频显示技术，人类胚胎干细胞和骨髓基质干细胞与荧光染料标签。这种技术可以用于移植的干细胞在体内追踪与光学成像和荧光显微镜观察组织病理学的相关性。

Abstract

光学成像（OI），是一个方便，快捷，廉价的新的干细胞治疗的体内监测的工具。该技术是基于体内的干细胞用荧光染料，随后静脉注射标记的细胞，在特定的靶器官或病理积累的可视化标签。所提出的技术演示我们如何由简单的孵化与亲脂性荧光染料标签人类间质干细胞（HMSC）（C67H103CIN2O3S），我们如何标签人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），美国FDA批准的荧光染料的吲哚菁绿（ICG）。吸收机制是通过坚持和推广整个磷脂细胞膜双层lypophilic染料。通常标记效率提高，如果细胞培养，而不是在含血清的介质中孵化的无血清培养基中的染料。此外，除了转染剂硫酸鱼精蛋白显着提高造影剂的吸收。

Protocol

间质干细胞的标记与荧光染料

1. 要开始标签间质干细胞的过程，trypsinize和细胞计数，以获得与一个细胞的定义暂停。
2. 的孵化器中取出细胞，吸出含有被标记的细胞培养瓶旧媒体
3. 10毫升的Mg / Ca无PBS清洗细胞。吸出的PBS。镁和钙会抑制胰蛋白酶，因此我们用PBS没有这些。
4. 加入预热的0.05％胰蛋白酶，为T75烧瓶中，我们使用5毫升。确保覆盖整个表面的容量瓶。
5. 在37 ° C的培养箱孵育约5分钟。
6. 在显微镜下确认支队。如果细胞仍然坚持到烧瓶中，点击了几次，再等一会儿，直到胰蛋白酶是成功。
7. 现在，它是必要的胰蛋白酶中加入含10％FCS的媒体。我们使用等量的媒体有胰蛋白酶。
8. 移液器上下几次，以确保所有的细胞重悬在媒体。
9. 转移到无菌15毫升上限聚丙烯管的电池解决方案。
10. 在400 RCF离心5分钟。
11. 确保不打扰细胞沉淀，吸出上清液。
12. 在DMEM重悬细胞，并进行细胞计数。
13. 暂停细胞标记在密度为1 × 10 ^每毫升6在无血清培养基（DMEM）。
14. 这是所有的细胞悬液的制备。现在，它已经准备好开始的标签。
15. 首先，添加5μLDID造影剂每毫升细胞悬液。
16. 然后，轻轻吹打混合的解决方案。
17. 孵育标签解决方案，在37 ° C时20分钟在6孔盘低附着的细胞。
18. 一旦完成简单的孵化，这是需要转移的细胞溶液15毫升的上限聚丙烯管。
19. 在400 RCF离心5分钟。
20. 吸出的标签介质，确保不干扰细胞沉淀。
21. 用PBS清洗细胞。移液器的细胞向上和向下，一定要打破细胞沉淀。
22. 重复两次后两个步骤，所以共3个洗涤步骤。
23. 计数细胞，并进行台盼蓝测试，以确定细胞活力。这些都是标准的细胞培养协议，我们不会在这里解释。
24. 现在已经准备好你的细胞在光学成像仪成像。

人类胚胎干细胞标记的荧光染料ICG

1. 要开始标签人类胚胎干细胞的过程，准备吲哚青绿造影剂。转代理鱼精蛋白混合。
2. 测量出1mg的吲哚青绿粉。在100μL二甲基亚砜（DMSO）溶解ICG的粉末。
3. 的混合物中加入400μL贝科修改老鹰培养基（DMEM + 10％胎牛血清）媒体和动摇。在终浓度为2mg/ml这个结果吲哚青绿。
4. 添加转代理鱼精蛋白。鱼精蛋白作为造影剂穿梭的行为，因此，它得到更有效地进入细胞。
5. 混合5μL硫酸鱼精蛋白，这是提供在浓度为10mg/ml，用300μLICG和300μL无血清贝科的修改老鹰中等，。
6. 轻轻摇动5分钟，新的转染的解决方案，让复杂的形式。
7. 标签解决方案已准备就绪。
8. 从人类胚胎干细胞10mm的培养皿中吸出旧媒体。
9. 加入预热的无血清DMEM5毫升。
10. 添加细胞先前准备的鱼精蛋白/ ICG的解决方案。开始由放置在一个孵化器在37菜1小时的潜伏期° C。
11. 孵化完成后，从孵化器中取出的菜，吸出的标签解决方案。
12. 冲洗菜用5 mL PBS清洗细胞。
13. 吸出PBS和更换与0.25％胰蛋白酶5毫升。菜在37℃5分钟，使胰蛋白酶发生。它有助于在一段时间的菜一点点每一次握手。
14. 轻轻吸液管向上和向下，打破剩余的殖民地。
15. 胰蛋白酶中加入等量的KSR菜。
16. 细胞溶液转移到15毫升管，离心5分钟，在400 RCF的解决方案。
17. 重悬细胞，在全媒体。
18. 如果仍然是在这一点上的团块，trypsinize离心一次。
19. 一个丛免费的电池解决方案实现后，吸出旧媒体和悬浮颗粒在10ml预热的全ESC媒体。
20. 在这一点上，它是必要的，从人类胚胎干细胞的小鼠饲养层细胞分开。这样做是为了确保以后，只有成像的干细胞发生。
21. 对于这一点，转移日E细胞明胶涂层10 cm培养皿的解决方案。
22. 放入37℃培养箱菜，让它坐了45分钟。在这段时间内，确保不打扰的菜。现在，进料器将坚持以菜和干细胞不会。
23. 转出的培养皿中的解决方案。现在我们有人类胚胎干细胞的一个标记的单细胞的解决方案。
24. 这些细胞现在可以计数和台盼蓝测试，可以对它们执行。
25. 细胞进行成像准备！

Discussion

Oi是一个相对较新的成像技术，荧光检测的基础上。 Oi是示踪剂成像技术的敏感，但不与任何辐射暴露关联。其他投资提供跟踪细胞的非侵入性的和重复的一个有效手段，从而提供了了解细胞迁移到目标站点。该技术的一个主要限制是有限的荧光探针在体内的组织渗透。因此，在深部组织的示踪积累，多约5-10厘米的皮肤表面，可能不会被发现。目前临床上的应用是有限的肤浅的技术，如内镜，心血管疾病和视网膜成像（Funovics等，2003），但将继续扩大这方面的研究领域，通过跟踪体内细胞提供了广阔的可能性的认可。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Biosciences	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners