Summary
Deze video toont technieken voor de etikettering van menselijke embryonale stamcellen en mesenchymale stamcellen met fluorescerende kleurstoffen. Deze techniek kan worden gebruikt voor een in-vivo volgen van getransplanteerde stamcellen met optische beeldvorming en voor histopathologisch correlaties met fluorescentie microscopie.
Abstract
Optische beeldvorming (OI) is een eenvoudige, snelle en goedkope tool voor in vivo monitoring van nieuwe stamceltherapieën. De techniek is gebaseerd op ex vivo etikettering van stamcellen met een fluorescerende kleurstof, latere intraveneuze injectie van de gelabelde cellen en visualisatie van hun accumulatie in specifieke doelorganen of pathologieën. De gepresenteerde techniek laat zien hoe we menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) label door eenvoudige incubatie met de lipofiele fluorescerende kleurstof DiD (C67H103CIN2O3S) en hoe we menselijke embryonale stamcellen (hESC) label met de FDA goedgekeurde fluorescerende kleurstof Indocyanine Green (ICG). De opname mechanisme is via de hechting en de verspreiding van de lypophilic kleurstof over de fosfolipide celmembraan bilaag. De etikettering rendement is meestal verbeterd als de cellen worden geïncubeerd met de kleurstof in serum-vrije media, in tegenstelling tot incubatie in serum-bevattende media. Bovendien is de toevoeging van de transfectie-agent protaminesulfaat verbetert aanzienlijk contrastmiddel opname.
Protocol
Etikettering van mesenchymale stamcellen met de fluorescerende kleurstof DiD
- Om te beginnen van de procedure voor het labelen van mesenchymale stamcellen, trypsinize en tellen van de cellen om een schorsing te krijgen met een bepaald aantal cellen.
- Neem de cellen uit de incubator en zuig die oude media uit de kolven met de cellen te worden geëtiketteerd
- Was de cellen met 10 ml Mg / Ca-vrij PBS. Aspireren de PBS. De Mg en Ca zou remmen het trypsine, dus we PBS te gebruiken zonder deze.
- Voeg voorverwarmde 0,05% trypsine, voor een T75 fles die we gebruiken 5ml. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van de kolf is bedekt.
- Incubeer bij 37 ° C in de incubator voor ongeveer 5 minuten.
- Bevestig het detachement onder de microscoop. Als de cellen blijven aan de kolf, tikt er een paar keer en wacht een iets langer totdat de behandeling met trypsine succesvol is.
- Nu, is het noodzakelijk om de trypsine te neutraliseren door het toevoegen van media met 10% FCS. We maken gebruik van een gelijke hoeveelheid media als er trypsine.
- Pipet op en neer een paar keer om ervoor te zorgen dat alle cellen opnieuw worden gesuspendeerd in de media.
- Breng de cel oplossing voor een steriele 15ml bedekte polypropyleen buis.
- Centrifugeer bij 400 RCF gedurende 5 minuten.
- Aspireren uit het supernatant ervoor te zorgen niet naar de cel pellet te verstoren.
- Resuspendeer de cellen in DMEM en ga verder met het celgetal.
- Hang de cellen worden gelabeld met een dichtheid van 1x10 ^ 6 per ml in serum-vrij kweekmedium (DMEM).
- Dit was allemaal voorbereiding van de celsuspensie. Nu is het klaar om de etikettering te starten.
- Voeg eerst 5 ul DiD contrastmiddel per ml celsuspensie.
- Vervolgens mengen de oplossing door voorzichtig pipetteren.
- Incubeer de cellen met de etikettering oplossing bij 37 ° C gedurende 20 minuten in een 6-well low-attachment schotel.
- Zodra de eenvoudige incubatietijd is voltooid, is het noodzakelijk om de cel oplossing over te dragen aan een 15 ml polypropyleen bedekte buis.
- Centrifugeer het neer op 400 RCF gedurende 5 minuten.
- Aspireren uit de etikettering medium, waardoor niet naar cel pellet te verstoren.
- Was de cellen met PBS. Pipetteer de cellen op en neer, en zorg ervoor dat breken de cel pellet.
- Herhaal de laatste twee stappen twee keer, dus er is een totaal van drie wasstappen.
- Tel het aantal cellen en het uitvoeren van een trypan blue test levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Dit zijn standaard celkweek protocollen die wij niet gaan hier uit te leggen.
- Uw cellen zijn nu klaar om te worden afgebeeld in optische imager.
Etikettering van menselijke embryonale stamcellen met de fluorescerende kleurstof ICG
- Om te beginnen van de procedure voor het labelen van menselijke embryonale stamcellen, de voorbereiding van de contrastmiddel Green Indocyanine. Meng het met de transfectie-agent Protamine.
- Meet 1 mg van het indocyaninegroen poeder. Los van de ICG poeder in 100 pi van dimethylsulfoxide (DMSO).
- Voeg 400 ul van Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM + 10% foetaal kalfsserum) media aan het mengsel en goed schudden. Dit resulteert in een uiteindelijke concentratie van 2mg/ml van Indocyanine Green.
- Voeg de transfectie-agent Protamine. Protamine fungeert als een shuttle naar het contrastmiddel, zodat het wordt in de cel efficiënter.
- Mix 5 microliter protaminesulfaat, die wordt geleverd bij een concentratie van 10mg/ml, met 300 il ICG en 300 pi serum vrij Dulbecco's Modified Eagles Medium.
- Schud de nieuwe transfectie-oplossing gedurende 5 minuten te laten complex te vormen.
- De etikettering oplossing is klaar.
- Zuigen uit de oude media uit hESC 10mm petrischaal.
- Voeg 5 ml van de voorverwarmde serum-vrij DMEM.
- Voeg de vooraf bereide Protamine / ICG oplossing voor de cellen. Start het 1 uur incubatie door het plaatsen van de schotel in een incubator bij 37 ° C.
- Na de incubatie is voltooid, verwijdert u de schotel uit de incubator en zuig de etikettering oplossing.
- Was de cellen door het spoelen van de schotel met 5 ml PBS.
- Aspireren van de PBS-en te vervangen door 5 ml van 0,25% trypsine. Incubeer de schotel op 37 ° C gedurende 5 minuten om trypsine te komen. Het helpt om de schotel te schudden een beetje elke keer in een tijdje.
- Voorzichtig pipet op en neer, te breken de resterende kolonies.
- Neutraliseer de Trypsine door het toevoegen van een gelijke hoeveelheid van KSR aan het gerecht.
- Breng de cel oplossing om een 15 ml buis en centrifugeer de oplossing bij 400 RCF gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cellen in volle media.
- Als er nog steeds massa's op dit punt, trypsinize en centrifuge opnieuw.
- Zodra een pol-vrije cel oplossing is bereikt, zuigen uit de oude media en resuspendeer de pellet in 10 ml van de voorverwarmde vol ESC media.
- Op dit punt, is het noodzakelijk om de muis feeder cellen van de hESC 's te scheiden. Dit is gedaan om ervoor te zorgen dat, later, maar de beeldvorming van de stamcellen zich voordoet.
- Voor deze, overdracht stee cel oplossing voor een gelatine coating 10 cm schotel.
- Zet de schotel in de 37 ° C incubator en laat het zitten voor 45 minuten. Gedurende deze tijd, zorg ervoor dat niet aan het gerecht te verstoren. Nu zal de feeders houden aan de schotel en de stamcellen niet.
- Breng de oplossing uit de petrischaal. en nu hebben we een gelabelde enkele cellen oplossing van menselijke embryonale stamcellen.
- De cellen kunnen nu worden geteld en een trypan blue test kan worden uitgevoerd op hen.
- De cellen zijn klaar om te worden afgebeeld!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI is een relatief nieuwe beeldvormende techniek, gebaseerd op de detectie van fluorescentie. OI is zo gevoelig als radiotracer op basis van beeldvormende technieken, maar niet geassocieerd met een bestraling blootstelling. OI biedt een effectief middel van het bijhouden cellen niet-invasieve en herhaaldelijk, waardoor inzicht in cel migratie naar de beoogde locatie. Een belangrijke beperking van de techniek is de beperkte penetratie van fluorescerende probes in vivo. Zo, een tracer accumulatie in diepe weefsels, meer dan ongeveer 5-10 cm van het huidoppervlak, kan niet worden gedetecteerd. Huidige klinische toepassingen zijn beperkt tot oppervlakkige technieken zoals endoscopische, cardiovasculaire en retinae imaging (Funovics et al.. 2003), maar dit domein van het onderzoek zal verder worden uitgebreid door de erkenning van de enorme mogelijkheden van in vivo cel tracking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door een Leon J. Thal SEED subsidie van het California Institute voor regeneratieve geneeskunde. Tobias Henning werd gefinancierd door een Research beurs van de Duitse Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Wij willen dankbaar Juanito Meneses te erkennen voor zijn advies over de cultuur van menselijke embryonale stamcellen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
