Summary
هذا الفيديو يبين تقنيات لوضع العلامات على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية الوسيطة مع الأصباغ الفلورية. ويمكن استخدام هذه التقنية لتتبع في الجسم الحي من الخلايا الجذعية التي تم زرعها مع التصوير الضوئي والارتباطات مع الأنسجة المجهري مضان.
Abstract
التصوير الضوئي (OI) هو أداة سهلة وسريعة وغير مكلفة لرصد المجراة في علاجات جديدة لبناء الخلايا الجذعية. وتستند هذه التقنية على وضع العلامات فيفو السابقين الخلايا الجذعية مع صبغة الفلورسنت ، والحقن في الوريد لاحقة من الخلايا وصفت والتصور من تراكمها في الأعضاء المستهدفة محددة أو الأمراض. أسلوب عرض يوضح كيف يمكننا تسمية الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة (hMSC) من حضانة بسيطة مع صبغ فلوري هل محبة للدهون (C67H103CIN2O3S) وكيف يمكننا تسمية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) مع ادارة الاغذية والعقاقير المعتمدة صبغة الفلورسنت خضرة الإندوسيانين (ICG). آلية امتصاص هو عبر التمسك ونشر الصبغة lypophilic عبر غشاء الخلية طبقة ثنائية فسفوليبيد. وعادة ما يتم تحسين كفاءة الوسم إذا المحتضنة الخلايا مع صبغة خالية في المصل وسائل الاعلام بدلا من الحضانة في مصل الدم التي تحتوي على وسائل الإعلام. علاوة على ذلك ، إضافة سلفات بروتامين ترنسفكأيشن كيل تحسن كبير في امتصاص النقيض عامل.
Protocol
توسيم الخلايا الجذعية الوسيطة مع صبغة الفلورسنت هل
- لبدء إجراءات لوضع العلامات الخلايا الجذعية الوسيطة ، ويعرض للتريبسين عدد الخلايا للحصول على تعليق مع عدد محدد من الخلايا.
- تأخذ الخلايا من الحاضنة ونضح من وسائل الإعلام القديمة من القوارير التي تحتوي على خلايا يمكن وصفها
- غسل الخلايا مع 10 مل من مغ / كا خالية من برنامج تلفزيوني. نضح بها في برنامج تلفزيوني. فإن المغنيسيوم والكالسيوم وتمنع التربسين ، وبالتالي فإننا نستخدم برنامج تلفزيوني من دون هذه.
- إضافة قبل التربسين تحسنت 0.05 ٪ ، وذلك لأننا نستخدم قارورة T75 5ml. ضمان أن يتم تغطية كامل سطح القارورة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
- تأكيد انفصال تحت المجهر. إذا كانت الخلايا لا تزال تلتزم القارورة ، اضغط عليها عدة مرات والانتظار لفترة أطول قليلا حتى trypsinization الناجحة.
- الآن ، فإنه من الضروري تحييد التربسين بإضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ FCS. نستخدم مبلغ مساو من وسائل الاعلام كما يوجد التربسين.
- ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان كافة الخلايا إعادة معلقة في وسائل الإعلام.
- نقل الخلية إلى حل عقيم 15ml الانبوب البولي بروبلين توج.
- الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
- نضح خارج طاف ضمان عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
- Resuspend الخلايا في DMEM والمضي قدما في عدد الخلايا.
- تعليق الخلايا ليكون المسمى في كثافة 1x10 ^ 6 في مل في مستنبت المصل الحرة (DMEM).
- وكان كل هذا التحضير لتعليق الخلية. الآن ، وانها مستعدة لبدء وضع العلامات.
- الأولى ، إضافة 5 ميكرولتر من عامل تباين هل مل من التعليق في الخلية.
- ثم ، مزيج الحل بواسطة pipetting بلطف.
- احتضان الخلايا مع الحل وضع العلامات عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في طبق المنخفضة المرفق 6 أيضا.
- بمجرد اكتمال حضانة بسيطة ، فمن الضروري لنقل الخلية إلى حل أنبوب 15 مل توج البولي بروبلين.
- أجهزة الطرد المركزي لأسفل في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
- نضح بها الوسم المتوسط ، وضمان عدم تعكير الخلية بيليه.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا ، والتأكد من لتفريق بيليه الخلية.
- كرر الخطوتين الأخيرتين أكثر من مرة ، حتى لا يكون هناك ما مجموعه 3 خطوات الغسيل.
- عدد الخلايا وإجراء اختبار لتحديد التريبان الأزرق بقاء الخلية. هذه الثقافة هي المعيار بروتوكولات الخلية أننا لن أشرح هنا.
- الخلايا الخاصة بك الآن على استعداد ليمكن تصوير في تصوير الضوئي.
توسيم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ICG صبغة الفلورسنت
- لبدء إجراءات لوضع العلامات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، وإعداد وكيل النقيض من خضرة الإندوسيانين. مزجها مع ترنسفكأيشن بروتامين الوكيل.
- قياس خارج 1mg من المسحوق خضرة الإندوسيانين. حل مسحوق ICG في 100 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
- إضافة 400 ميكرولتر من النسور Dulbecco ومتوسطة التعديل (العجل الجنين DMEM + 10 ٪ المصل) وسائل الإعلام إلى الخليط ويهز جيدا. هذه النتائج في التركيز النهائي لل2mg/ml من خضرة الإندوسيانين.
- إضافة بروتامين كيل ترنسفكأيشن. بروتامين الأفعال باعتبارها وكيلا للمكوك النقيض من ذلك ، بحيث يحصل داخل الخلية بشكل أكثر كفاءة.
- مزيج 5 سلفات بروتامين ميكرولتر ، والتي يتم توفيرها في تركيز 10mg/ml ، مع 300 و 300 ميكرولتر ICG ميكرولتر المصل الحرة Dulbecco ومتوسطة النسور التعديل.
- يهز بلطف الحل ترنسفكأيشن جديدة لمدة 5 دقائق للسماح معقدة لتشكيل.
- الحل هو وضع العلامات جاهزة.
- نضح من وسائل الإعلام القديمة من طبق بيتري hESC 10MM.
- إضافة 5ml من المصل DMEM خالية قبل تحسنت.
- إضافة الحل أعدت مسبقا بروتامين / ICG إلى الخلايا. بدء الحضانة 1 ساعة عن طريق وضع الطبق في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- بعد اكتمال الحضانة ، وإزالة الطبق من الحاضنة ونضح من الحل التوسيم.
- غسل الخلايا وذلك بدهن الطبق مع PBS 5 مل.
- نضح بها في برنامج تلفزيوني واستبدال التربسين 5ml من 0.25 ٪. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح trypsinization تحدث. فهو يساعد على التخلص الطبق قليلا في كل مرة واحدة في حين لاخر.
- ماصة بلطف صعودا ونزولا ، لتفريق المستعمرات المتبقية.
- تحييد التربسين بإضافة مبلغ مساو من KSR إلى الطبق.
- نقل الخلية إلى حل 15ml أنبوب الطرد المركزي والحل في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
- Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام الكاملة.
- إذا كان لا يزال هناك كتل عند هذه النقطة ، ويعرض للتريبسين الطرد المركزي مرة أخرى.
- حالما يتم التوصل إلى حل أجمة خالية من الخلية ، ونضح من وسائل الإعلام القديمة وresuspend لبيليه في 10ML من قبل وسائل الإعلام تحسنت ESC الكامل.
- عند هذه النقطة ، فمن الضروري فصل الخلايا المغذية الماوس من hESCs. يتم ذلك لضمان أنه في وقت لاحق ، فقط تصوير الخلايا الجذعية يحدث.
- لهذا ، ونقل عشرةه حل خلية إلى الجيلاتين المغلفة طبق 10 سم.
- وضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية واتركه لمدة 45 دقيقة. خلال هذا الوقت ، تأكد من عدم تعكير صفو الطبق. الآن ، سوف تلتزم مغذيات الطبق والخلايا الجذعية لن.
- نقل الحل للخروج من صحن بيتري. والآن لدينا الحل الخلايا المسمى واحد من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
- ويمكن الآن أن تحسب الخلايا ، ويمكن إجراء اختبار أزرق التريبان عليها.
- الخلايا جاهزة للتصوير!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI هي تقنية تصوير جديدة نسبيا ، استنادا إلى الكشف عن مضان. OI حساسة مثل تقنيات التصوير قائف مشع مقرها ، ولكن لا يرتبط مع أي التعرض لأشعة. OI يوفر وسيلة فعالة لتعقب الخلايا غير جراحية ومتكررة ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة الهجرة الخلية إلى موقع الهدف. أحد أوجه القصور الرئيسية لهذا الأسلوب هو اختراق محدود من الانسجة في الجسم الحي تحقيقات الفلورسنت. وهكذا ، فإن تراكم التتبع في الأنسجة العميقة ، أكثر من حوالي 50-10 سم من سطح الجلد ، قد لا يتم الكشف عن. وتقتصر التطبيقات السريرية الحالية إلى تقنيات مثل التصوير السطحي بالمنظار ، والقلب والأوعية الدموية للشبكية (Funovics وآخرون 2003) ولكن هذا المجال من البحث سوف تستمر في التوسع من خلال الاعتراف الإمكانيات الهائلة التي توفرها في تعقب الخلايا الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع من خلال منحة ليون J. SEED تال من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي. ومولت من قبل توبياس هينينغ بحوث راتب من جمعية البحوث الألمانية (DFG ، وسعادة 4578/1-2). نحن نريد أن نعترف بامتنان مينيسيس خوانيتو لنصائحه حول ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
