Summary
Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.
Abstract
Óptico de imagem (OI) é uma ferramenta fácil, rápida e barata para a monitorização in vivo de terapias à base de células-tronco novo. A técnica é baseada na rotulagem ex vivo de células-tronco com um corante fluorescente, injeção intravenosa subsequente das células rotuladas e visualização de sua acumulação em órgãos-alvo específicos ou patologias. A técnica apresentada demonstra como nós rotulamos células-tronco mesenquimais (hMSC) por incubação simples com o corante lipofílico fluorescente DiD (C67H103CIN2O3S) e como nós rotulamos células-tronco embrionárias (CTEh) com o FDA aprovou o corante fluorescente indocianina verde (ICG). O mecanismo de absorção é através de adesão e difusão do corante lypophilic através da bicamada fosfolipídica da membrana celular. A eficiência de marcação é normalmente melhorado se as células são incubadas com o corante, isento de soro de mídia em vez de incubação em soro contendo mídia. Além disso, a adição do sulfato de protamina transfecção agente melhora significativamente a absorção de agente de contraste.
Protocol
Rotulagem de células-tronco mesenquimais com o corante fluorescente DiD
- Para iniciar o procedimento para a rotulagem de células-tronco mesenquimais, trypsinize e contar as células para obter uma suspensão com um número definido de células.
- Tome as células fora da incubadora e aspirar a media de idade dos frascos contendo as células a serem rotulados
- Lavar as células com 10 ml de Mg / Ca-free PBS. Aspirar o PBS. O Mg e Ca inibiria o Tripsina, portanto usamos PBS sem eles.
- Adicionar pré-aquecido Tripsina 0,05%, para um frasco T75 usamos 5ml. Assegurar que toda a superfície do frasco é coberto.
- Incubar a 37 ° C na incubadora por aproximadamente 5 minutos.
- Confirme o destacamento sob o microscópio. Se as células continuam a aderir ao balão, toque-o algumas vezes e esperar um pouco mais até que a tripsinização é bem sucedida.
- Agora, é necessário neutralizar a tripsina, adicionando a mídia contendo 10% SFB. Nós usamos uma quantidade igual de mídia como há Tripsina.
- Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para garantir que todas as células são re-suspenso na mídia.
- Transferir a solução de célula para um tubo de polipropileno estéril 15ml tampado.
- Centrifugar a 400 rcf durante 5 minutos.
- Aspirar o sobrenadante garantindo não perturbar o pellet celular.
- Ressuspender as células em DMEM e prosseguir com a contagem de células.
- Suspender as células a ser rotulados com uma densidade de 1x10 ^ 6 por ml em soro livre de meio de cultura (DMEM).
- Esta foi toda a preparação da suspensão de células. Agora, ele está pronto para iniciar a rotulagem.
- Primeiro, adicione 5 mL de contraste DiD por ml de suspensão celular.
- Em seguida, misturar a solução com cuidado pipetando.
- Incubar as células com a solução de rotulagem a 37 ° C por 20 minutos em um prato bem 6-apego-baixo.
- Uma vez que a incubação simples é completo, é necessário transferir a solução de célula para um tubo de polipropileno 15 ml tampados.
- Centrífuga para baixo a 400 rcf durante 5 minutos.
- Aspirar o meio de rotulagem, garantindo não perturbar pellet celular.
- Lavar as células com PBS. Pipeta as células para cima e para baixo, certificando-se de quebrar o pellet celular.
- Repita os dois últimos passos mais duas vezes, para que haja um total de 3 etapas de lavagem.
- Contar as células e executar um teste de Trypan azul para determinar a viabilidade celular. Estes são protocolos padrão da pilha cultura que não vamos explicar aqui.
- Suas células estão prontas a ser trabalhada no imager óptica.
Rotulagem de células estaminais embrionárias humanas com o ICG corante fluorescente
- Para iniciar o procedimento para a rotulagem células estaminais embrionárias humanas, prepare o agente de contraste Indocianina Verde. Misturá-lo com o agente de transfecção de protamina.
- Meça 1mg do pó Indocianina Verde. Dissolver o pó ICG em 100 mL de dimetil sulfóxido (DMSO).
- Adicionar 400 mL de Modified Dulbecco Eagles Medium (DMEM + 10% Calf Serum Fetal) meios de comunicação para a mistura e mexa bem. Isso resulta em uma concentração final de 2mg/ml de Indocianina Verde.
- Adicione o Protamina agente de transfecção. Protamina atua como serviço de transporte para o agente de contraste, de modo que fica dentro da célula mais eficiente.
- Mistura de 5 mL de sulfato de protamina, que é fornecido em uma concentração de 10mg/ml, com 300 mL ICG e 300 mL de soro livre Dulbecco Modificado Médio Eagles.
- Agite suavemente a solução de transfecção novo por 5 minutos para permitir complexo a se formar.
- A solução rotulagem está pronto.
- Aspirar a velha mídia a partir CTEh placa de Petri de 10mm.
- Adicionar 5 ml de soro pré-aquecido sem DMEM.
- Adicionar a solução preparada anteriormente Protamina / ICG para as células. Iniciar a incubação de 1 hora de colocar o prato em uma incubadora a 37 ° C.
- Após a incubação estiver completa, remova o prato da incubadora e aspire a solução de rotulagem.
- Lavar as células por lavagem do prato com 5 ml de PBS.
- Aspirar o PBS e substituir com 5 ml de tripsina 0,25%. Incubar o prato a 37 ° C por 5 minutos para permitir que tripsinização a ocorrer. Ela ajuda a agitar o prato um pouco de vez em quando.
- Pipeta suavemente para cima e para baixo, para acabar com as colônias restantes.
- Neutralizar a tripsina, adicionando uma quantidade igual de KSR ao prato.
- Transferir a solução de células para um tubo de 15ml e centrifugar a solução a 400 rcf durante 5 minutos.
- Ressuspender as células em meios de comunicação completa.
- Se ainda há aglomerações, neste ponto, trypsinize e centrifugar novamente.
- Uma vez que um aglomerado de células sem solução é alcançada, aspirar a velha mídia e ressuspender o sedimento em 10ml de pré-aquecido media total ESC.
- Neste ponto, é necessário separar as células de camundongos a partir do alimentador hESCs. Isto é feito para garantir que, mais tarde, apenas as células-tronco da imagem ocorre.
- Para isso, a transferência ªe solução de célula para um prato de gelatina centímetros revestidas 10.
- Coloque o prato para a 37 ° C incubadora e deixe descansar por 45 minutos. Durante este tempo, certifique-se para não perturbar o prato. Agora, os alimentadores irá aderir ao prato e as células-tronco não.
- Transferir a solução para fora da placa de Petri. e agora temos uma solução rotulados células isoladas de células estaminais embrionárias humanas.
- As células podem agora ser contada e um teste de Trypan azul pode ser realizada sobre eles.
- As células estão prontos para ser fotografada!
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Discussion
OI é uma relativamente nova técnica de imageamento, com base na detecção de fluorescência. OI é tão sensível quanto técnicas de radiofármaco baseado em imagem, mas não associados com a exposição a irradiação. OI fornece um meio eficaz de rastreamento de células não-invasiva e repetidamente, assim, fornecendo informações sobre a migração celular para o site de destino. Uma grande limitação da técnica é a penetração nos tecidos limitado de sondas fluorescentes in vivo. Assim, um acúmulo de marcador nos tecidos profundos, mais do que cerca de 5-10 cm da superfície da pele, pode não ser detectado. Atuais aplicações clínicas estão limitadas a técnicas superficiais, tais como imagem endoscópica, cardiovascular e retina (Funovics et al. 2003), mas este domínio da investigação continuará a se expandir através do reconhecimento das vastas possibilidades oferecidas por no rastreamento de celular vivo.
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Acknowledgments
Este projeto foi suportado por uma concessão SEED Leon J. Thal do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia. Tobias Henning foi financiado por uma bolsa de Pesquisa do alemão Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Queremos agradecem Meneses Juanito para o seu conselho sobre a cultura de células estaminais embrionárias humanas.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
