Мы показываем, простой и быстрый метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и поддерживать их на эмбриоидных развития организма.
Эмбриоидных органов (EB) являются агрегатами эмбриональных стволовых клеток. Наиболее распространенным способом создания этих агрегатов методом висячей капли, трудоемкий подход пипетирования произвольное количество клеток в хорошо пластин. Взаимодействий между стволовыми клетками вынуждены непосредственной близости друг от друга способствует поколения EBS. Потому что средства массовой информации в каждой из скважин вручную обменялись каждый день, этот подход вручную интенсивно.
Более того, поскольку параметры окружающей среды, включая сотовые-ячейки и растворимые взаимодействия фактора, рН и наличие кислорода могут быть функциями EB размер, клеточных популяций получены от традиционных висят капли могут резко меняться даже при культивировании в одинаковых условиях. Недавние исследования показали, что действительно начальное количество клеток, образующих совокупности может оказать существенное воздействие на стволовые дифференциации клеток. Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот метод поддается любой лаборатории и не требует специализированного оборудования. Мы показываем этот метод путем создания эмбриоидных органов использованием красного флуоресцентного клеточной линии мыши (129S6B6-F1).
Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин (отлит из Shrinky-Dinks) и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот мет?…
Мы хотели бы поблагодарить CIRM за поддержку этой работы. Клеточная линия была щедро пожертвовал от доктора Андраш Надь в больнице Маунт Синай в Торонто, Онтарио.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) |