توليد خلايا الجذع من خلال التعبير MEFS القسري لل2 - سوكس ، أكتوبر 4 ، ج Myc وKlf4

Summary

هذا الفيديو يبين الداخلي الناجم عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الفيروسة البطيئة التي تعبر عن محرض Oct4 ، Sox2 ، ج Myc وKlf4.

Abstract

يمكن أن يتسبب تعدد القدرات المتباينة في الفئران التي تنبيغ الفيروسية Oct4 ، Sox2 ، Klf4 و c - Myc (تاكاهاشي وياماناكا ، 2006 ؛ Wernig ، وآخرون ، 2007 ؛. أوكيتا ، وآخرون ، 2007 ؛. Maherali ، وآخرون ، 2007). لقد وضعنا استراتيجية إعادة برمجة التي يعبر عنها في هذه عوامل النسخ الأربعة من الدوكسيسيكلين (دوكس) - محرض ناقلات lentiviral (Brambrink وآخرون ، 2008). تستخدم هذه التركيبات محرض ، يمكننا استخلاص الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) من الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). في هذا الفيديو ، ونحن لشرح إجراءات لتوليد lentiviruses محرض التي تعبر عن عوامل النسخ الأربع وتظهر كيف أن تصيب هذه الفيروسات مع MEFs لانتاج خلايا الجذع. باستخدام lentiviruses محرض ، والتعبير عن العوامل الأربعة التي يسيطر عليها إضافة إلى doxycyline متوسطة الثقافة. ميزة هذا النظام أكثر من العدوى فيروسات التقليدية هي القدرة على تحويل الجينات على ذلك والتي يمكن الخروج بتحليل حركية ومتطلبات إعادة برمجة الجينات بالتفصيل.

Protocol

الخطوة 1 :

ذوبان الجليد من أصل 293 لوحة والخلايا لإنتاج الفيروسة البطيئة.

1. إعداد 9 مل من المتوسط ​​+ DMEM في أنبوب 15 مل.
2. إزالة 293 قنينة من الأسهم المجمدة من خزان النتروجين السائل ووضع القارورة في حمام ماء C ° 37 حتى يتم إذابة الخلايا معظم (ولكن ليس كلها).
3. إزالة الخلايا من قارورة تجميد ومكان داخل الأنبوب 15ml من الخطوة 1.
4. الطرد المركزي في 180g لمدة 5 دقائق ، ثم تجاهل طاف.
5. Resuspend الخلايا مع 10 مل من المتوسط ​​+ DMEM ، ونقل إلى صحن 100 ملم الجيلاتين المغلفة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO ₂ الحاضنة حتى يتم متموجة 80-90 ٪.
6. مرور 293 من الخلايا : الخلايا يغسل مع برنامج تلفزيوني ، نضح في برنامج تلفزيوني ، وإضافة 4 مل لكل 10 سم ، وطبق من 0.05 ٪ trypsin/0.53 ملي EDTA ، واحتضان ل1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
7. فصل الخلايا من الأطباق من خلال استغلال ، مع resuspend DMEM مل 10 + المتوسطة ، ونقل إلى أنبوب 15 مل. الطرد المركزي في 180g لمدة 5 دقائق ، ونضح وطاف.
8. إضافة حجم مناسب لDMEM + المتوسطة ، وتفتيت الخلايا في خلية واحدة من قبل تعليق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
9. حساب عدد الخلايا وضبط تركيز على الخلايا 8X10 في ⁵ مل مع FP المتوسطة.
10. خلايا المصنف في الخلايا ⁶ 8X10 (10 مل) في صحن الثقافة 100 ملم ، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2.

الخطوة 2 :

293 Transfect الخلايا مع البلازميدات الفيروسة البطيئة وفيروس الحصاد

1. عن كل لوحة 10 سم ، 10 ميكروغرام من استخدام FUW - تيتو ، [كدنا] (Oct4 ، Sox2 ، أو Klf4 Myc ج) العمود الفقري لل2.5ug الفيروسة البطيئة مع PMD - G و 7.5 ميكروغرام من pPax2.
2. وبينما aliquoting البلازميدات الثلاثة في أنبوب ، وتقديم 30μl من كاشف Fugene ترنسفكأيشن 6 في أنبوب ثانية تحتوي على 500μl DMEM من دون خلط المصل وبلطف بواسطة الإصبع التنصت واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. إضافة مزيج الحمض النووي قطرة تلو قطرة في أنبوب Fugene 6/DMEM-containing ، مزيج بلطف التنصت على اصبع واحتضان لمدة 20 دقيقة.
4. إضافة DNA / 6 Fugene قطرة قطرة المعقدة الى الطبق من 293 ، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO _2.
5. صباح اليوم التالي : نضح في ترنسفكأيشن كاشف المحتوية على المتوسط ​​، اضافة 5 مل من جديد وفاق المتوسط ​​الخلية ، والعودة إلى الخلايا الحاضنة.
6. في 48 ساعة و 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، وجمع من المتوسط ​​في 293 وباستخدام 10 مل المحاقن المعقمة المتاح ، من خلال تصفية حجم المسام 0.45 ميكرون تصفية - خلات السليلوز ، ونقل في أنبوب 15 مل.
7. طاف تركيز الفيروس عن طريق تنبيذ فائق. Resuspend الكرية الفيروس في الحجم المطلوب وجعل amixture من أجزاء متساوية من المتوسط ​​تحتوي على Oct-3/4- ، Sox2 ، Klf4 و- C - Myc lentiviruses.
8. في حين جعل الفيروس ، أو إعداد Oct4-neo/rtTA MEFs Oct4-GFP/rtTA (مرور <3) إلى 90 ٪ confluency في 10 سم ، والأطباق (2x10 ⁶ خلايا في طبق)
9. نضح على المديين المتوسط ​​والثقافة ، وتغسل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
10. تجاهل برنامج تلفزيوني ، إضافة 1 مل لكل طبق من 0.05 ٪ trypsin/0.53 ملي EDTA ، واحتضان في 37 دقيقة لمدة 10 درجة مئوية.
11. إضافة 9 مل من المتوسط ​​الثقافة ، ووقف الخلايا لخلية واحدة ، ونقل إلى أنبوب 15 مل.
12. حساب عدد الخلايا ، وضبط تركيز على الخلايا ⁴ 8X10 لكل مليلتر. نقل 10 مل من التعليق الخلية (8X10 ⁵ خلايا) على طبق 10 سم مغلفة مع الجيلاتين. احتضان الطبق بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2.
13. نضح المتوسط ​​من الطبق الليفية ، وإضافة 10 مل من المتوسط ​​تحتوي على الفيروس. احتضان الخلايا من 4 ساعات ليلة وضحاها إلى 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2.
14. بعد 24 نضح المتوسط ​​طبق من الخلايا الليفية ، وإضافة 10 مل من جديد وفاق متوسط ​​الخلية.
15. استبدال الخلايا العادية المتوسطة وفاق مع دوكسي المتوسط ​​تحتوي على الشروع في التعبير عن الجينات الأربعة ؛ وبعبارة أخرى ، والشروع في إعادة برمجة.
16. إذا باستخدام مراسل Oct4 الجدد ، ثم الشروع في القسم المخدرات في أي وقت ما بين 6 و 9 أيام.
17. تغيير المتوسط ​​كل يوم حتى تصبح مستعمرات كبيرة بما يكفي ليتم انتقاؤها. وينبغي أن المستعمرات بهذا يصبح مرئية تقريبا بعد اسبوع من بدء إعادة برمجة. ينبغي أن تصبح كبيرة بما يكفي لتكون التقطت حوالي 20 يوما.

الخطوة 3 :

التقاط المستعمرات الجذع

اليوم قبل الإلتقاط :

1. البذور العدد المطلوب من لوحات 24 الجيلاتين المغلفة جيدا مع MEFs DR4 γ - المشع

قطف المستنسخون يوم 1 :

1. تغذية المستعمرات على لوحات 1-2 قبل ساعات من حصوله.
2. إضافة ميكرولتر من 15 برنامج تلفزيوني على طبق من الآبار V - 96 - القاع أيضا.
3. غسل الأطباق التي تحتوي على ويمكن الحصول عليها المستعمرات مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة إلى برنامج تلفزيوني 10ML من الطبق.
4. اختيار المستعمرات مع نصائح الماصة 5μl الصغيرة (تعيين pipetman P20 في 4 ميكرولتر). نقل المشتركlonies إلى بئر في الصحن 96 - جيدا.
5. إضافة 20 ميكرولتر التربسين إلى كل من به جيدا متعدد القنوات (12) pipetor. الماصة صعودا وهبوطا 3 مرات. احتضان في 37 لمدة 4 دقائق درجة مئوية.
6. إضافة 100 ميكرولتر من وفاق المتوسط ​​إلى المستعمرات trypsinized. الماصة صعودا ونزولا 10 مرات. 6 نقل الحيوانات المستنسخة في وقت واحد من الطبق إلى جانب 96 - 24 - طبق بشكل جيد باستخدام معلومات سرية في كل مركز آخر في مكان pipetor 12.
7. تنمو الخلايا على لوحة ال 24 بشكل جيد في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO ₂ حاضنة حتى تصل إلى 80-90 ٪ الخلايا confluency ، تغذية يومية مع وفاق متوسط ​​الخلية. وسوف يكون على الارجح خلايا جاهزة للتوسع في 3-7 أيام.

الخطوة 4

1. التوسع في خلايا الجذع
   1. نضح المتوسط ​​، وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
   2. إزالة PBS تماما ، إضافة 0.1 مل من 0.25 ٪ التربسين / 1 ملم واحتضان EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   3. إضافة 0.4 مل من المتوسط ​​وفاق وتعليق الخلايا pipetting صعودا وهبوطا إلى تعليق خلية واحدة.
   4. نقل تعليق خلية إلى جانب لوحة 6 - جيدا ، إضافة 1.5 مل الخلية ES المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO ₂ الخلايا الحاضنة حتى تصل 80-90 ٪ confluency في 6 لوحات جيدا. عند هذه النقطة ، إعداد الأوراق المالية المجمدة للخلايا ، كما يلي.
2. إعداد تجميد الأسهم
   1. نضح المتوسط ​​، وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
   2. إزالة PBS تماما ، إضافة 0.5 مل من 0.25 ٪ التربسين / 1 ملم واحتضان EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   3. إضافة 2 مل من المتوسط ​​وفاق وتعليق الخلايا pipetting صعودا وهبوطا إلى تعليق خلية واحدة.
   4. تعليق نقل الخلية إلى أنبوب 15 مل ، وحساب عدد الخلايا وتدور باستمرار الخلايا.
   5. تجاهل طاف ، resuspend الخلايا مع وفاق المتوسط ​​للتركيز على الخلايا 2x10 في ⁶ مل.
   6. 2 إعداد تجميد الخلايا المتوسطة ES (DMSO 20 ٪ في المتوسط ​​ES) وقسامة أنه عند 0.5 مل في القارورة.
   7. نقل 0.5 مل من تعليق لتجميد الخلايا قنينات والمزيج بلطف.
   8. وضع قنينة في حاوية تجميد الخلايا والحفاظ عليه في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، ونقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي للتخزين الطويل الأجل.

Discussion

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية استخدام محرض ، ونظام لتوليد lentiviral GFP إيجابية ، المحفزة الجذع خلايا من MEFs المستمدة من الفئران وOct4-GFP/R26-M2rtTA Nanog-GFP/R26-M2rtTA. هذا الإجراء هو وسيلة مفيدة لتوليد خلايا الجذع لأنه يسمح للتحكم في التعبير التحوير خلال عملية إعادة البرمجة. على الرغم من أن استخدام الفيروسات في توليد خلايا الجذع يعوق استخدام هذه الخلايا في عملية إعداد سريرية ، وهذا الإجراء لا تمكننا من الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية التي البيولوجية التأكيد على إعادة برمجة عملية محددة حتى الآن.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G