Générer des cellules iPS de MEFS travers l'expression forcée de Sox-2, Oct-4, c-Myc et Klf4

Summary

Cette vidéo montre la procédure pour générer des cellules souches pluripotentes induites à l'aide de lentivirus inductibles qui expriment Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4.

Abstract

Pluripotence peut être induite dans murines différenciées par transduction virale de Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc (Takahashi et Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Nous avons élaboré une stratégie de reprogrammation dans laquelle ces facteurs de transcription quatre sont exprimés à partir de doxycycline (Dox) inductible par des vecteurs lentiviraux (Brambrink et al., 2008). En utilisant ces constructions inductible, on peut dériver souches pluripotentes induites (iPS) à partir de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure pour la génération des lentivirus inductibles qui expriment les quatre facteurs de transcription et de montrer comment à infecter MEFs par ces virus, afin de produire des cellules iPS. En utilisant des lentivirus inductible, l'expression des quatre facteurs dans contrôlées par l'ajout de doxycycline au milieu de culture. L'avantage de ce système au cours de l'infection rétrovirale est traditionnelle de la capacité de transformer les gènes sur et en dehors de sorte que la cinétique de la reprogrammation et les exigences expression des gènes peut être analysé en détail.

Protocol

Etape 1:

Dégeler les cellules 293 et ​​la plaque pour la production de lentivirus.

1. Préparer 9 ml de DMEM + support dans un tube de 15 ml.
2. Retirer un flacon de 293 stocks congelés à partir du réservoir d'azote liquide et mettre le flacon dans un bain à 37 ° C jusqu'à ce que la plupart des cellules (mais pas tous) sont décongelés.
3. Éliminer les cellules du flacon de gel et le placer dans le tube 15ml de l'étape 1.
4. Centrifuger à 180g pendant 5 min, puis jeter le surnageant.
5. Resuspendre les cellules avec 10 ml de DMEM + support, et le transfert d'une gélatine à revêtement de 100 mm plat. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur jusqu'à ce qu'ils soient confluentes à 80-90%.
6. Passage des 293 cellules: les cellules de lavage avec du PBS, aspirer le PBS et ajouter 4 ml par 10 cm de plat de 0,05% trypsin/0.53 mM d'EDTA, et incuber pendant 1 min à 37 ° C.
7. Détachez les cellules à partir des plats en tapant, resuspendre avec 10 ml de DMEM + support, et le transfert d'un tube de 15 ml. Centrifuger à 180g pendant 5 min, et aspirer le surnageant.
8. Ajouter le volume approprié de DMEM + support, et briser les cellules dans une suspension cellulaire unique par aspiration et refoulement à plusieurs reprises.
9. Comptez le nombre de cellules et d'ajuster la concentration à 8x10 ⁵ cellules par ml avec le milieu de PF.
10. Cellules des semences à 8x10 ⁶ cellules (10 ml) par boîte de culture de 100 mm et incuber une nuit à 37 ° C, 5% de CO _2.

Étape 2:

Transfecter des cellules avec des plasmides 293 lentivirus et le virus de la récolte

1. Pour chaque plaque de 10 cm, utiliser 10 ug de FUW-tetO-ADNc (Oct4, Sox2, Klf4 ou c-Myc) épine dorsale des lentivirus avec 2.5ug des PMD-G et 7,5 ug d'pPax2.
2. Alors que les trois plasmides aliquotage dans un tube, livrer 30μl de réactif de transfection Fugene 6 dans un second tube contenant 500μl de DMEM sans sérum et mélanger délicatement avec le doigt tapant et incuber pendant 5 min à température ambiante.
3. Ajouter le mélange d'ADN au goutte-à-goutte dans le tube Fugene 6/DMEM-containing, mélanger délicatement en tapotant des doigts et incuber pendant 20 min.
4. Ajouter l'ADN / 6 Fugene goutte à goutte complexes dans le plat de 293, et incuber une nuit à 37 ° C, 5% de CO _2.
5. Le lendemain matin: Aspirer le réactif de transfection contenant du milieu, ajoutez 5 ml de milieu de cellules ES frais, et le retour des cellules dans l'incubateur.
6. À 48 heures et 72 heures après la transfection, de recueillir le support de la 293 en utilisant une de 10 ml seringue stérile à usage unique, le filtrant à travers un filtre de 0,45 um de taille de l'acétate de cellulose, des pores, et transférer dans un tube de 15 ml.
7. Concentrer le surnageant de virus par ultracentrifugation. Reprendre le culot de virus dans le volume désiré et faire amixture à parts égales du milieu contenant Oct-3/4-, Sox2-, Klf4-et c-Myc-lentivirus.
8. Tout en faisant le virus, de préparer ou de Oct4-neo/rtTA Oct4-GFP/rtTA FAE (passage <3) à 90% de confluence dans des plats de 10 cm (2x10 ⁶ cellules par boîte)
9. Aspirer le milieu de culture et laver avec 10 ml de PBS.
10. Jeter PBS, ajouter 1 ml par boîte de 0,05% trypsin/0.53 mM d'EDTA, et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
11. Ajouter 9 ml de milieu de culture, de suspendre les cellules à une seule cellule, et le transfert d'un tube de 15 ml.
12. Comptez le nombre de cellules, et d'ajuster la concentration à 8x10 ⁴ cellules par ml. Transférer 10 ml de suspension cellulaire (8x10 ⁵ cellules) pour un plat de 10 cm recouvert d'gélatine. Incuber le plat une nuit à 37 ° C, 5% de CO _2.
13. Aspirer le support d'un plat de fibroblastes, et ajouter 10 ml de milieu contenant le virus. Incuber les cellules à partir de 4 h à une nuit à 37 ° C, 5% de CO _2.
14. Après 24 aspirer le support d'un plat de fibroblastes, et ajouter 10 ml de milieu de cellules ES frais.
15. Remplacer régulièrement moyennes de cellules ES avec la doxycycline milieu contenant de lancer l'expression des quatre gènes; en d'autres termes, initier une reprogrammation.
16. Si vous utilisez un journaliste néo-Oct4, puis de lancer la section des médicaments à tout moment entre 6 et 9 jours.
17. Changer le support tous les jours jusqu'à les colonies deviennent assez gros pour être ramassé. Colonies doit d'abord devenir visibles environ une semaine après le début de la reprogrammation. Ils devraient devenir suffisamment importante pour être ramassé autour du jour 20.

Étape 3:

Reprenant les colonies iPS

La veille des vendanges:

1. Seed le nombre requis de gélatine revêtement des plaques 24 puits avec des γ-irradiés DR4 FAE

Cueillette des clones sur le Jour 1:

1. Flux des colonies sur les plaques de 1-2 heures avant la cueillette.
2. Ajouter 15 ul de PBS dans les puits d'un plat à fond en V de 96 puits.
3. Laver la capsule contenant les colonies à être cueillies une fois avec du PBS et ajouter 10 ml de PBS dans le plat.
4. Choisissez les colonies avec les petits conseils pipette 5uL (réglez le Pipetman P20 sur 4 pi). Transfert colonies d'un puits dans le plat de 96 puits.
5. Ajouter 20 ul de trypsine dans chaque puits en utilisant le multi-canal (12) pipetor. Pipet haut et en bas trois fois. Incuber à 37 ° C pendant 4 minutes.
6. Ajouter 100 pi de milieu ES pour les colonies trypsinisées. Pipet haut et en bas 10 fois. Transfert 6 clones à une époque de l'antenne de 96 puits dans un plat de 24 puits en utilisant une pointe à chaque position d'autres sur le pipetor 12 place.
7. Cultiver les cellules sur la plaque de 24 puits dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ de l'incubateur jusqu'à atteindre 80-90% des cellules de confluence, l'alimentation quotidienne avec un milieu de cellules ES. Cellules sera probablement prêt à se développer dans 3-7 jours.

Etape 4

1. Expansion des cellules iPS
   1. Aspirer le milieu, et laver les cellules avec 1 ml de PBS.
   2. Retirer du PBS complètement, ajouter 0,1 ml de 0,25% de trypsine / EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
   3. Ajouter 0,4 ml de milieu ES et les cellules en suspension de pipetage haut et bas pour suspension cellulaire unique.
   4. Transférer la suspension cellulaire à un puits de la plaque de 6 puits, ajouter 1,5 ml de cellules ES moyennes, et incuber dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur jusqu'à atteindre 80-90% des cellules de confluence dans des plaques 6 puits. A ce point, préparer stock congelé des cellules, comme suit.
2. Préparation de stock gel
   1. Aspirer le milieu, et laver les cellules avec 2 ml de PBS.
   2. Retirer du PBS complètement, ajoutez 0,5 ml de 0,25% de trypsine / EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
   3. Ajouter 2 ml de milieu ES et les cellules en suspension de pipetage haut et bas pour suspension cellulaire unique.
   4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml, comptez le nombre de cellules et de spin-down des cellules.
   5. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules avec le milieu ES à la concentration à 2x10 ⁶ cellules par ml.
   6. Préparer 2 milieu de congélation de cellules ES (DMSO 20% en ES moyenne) et il aliquote de 0,5 ml par flacon.
   7. Transfert de 0,5 ml de la suspension cellulaire de geler les flacons et mélanger doucement.
   8. Mettez les flacons dans un contenant de congélation des cellules et le conserver à -80 ° C pendant la nuit; transfert à l'azote liquide le lendemain pour stockage à long terme.

Discussion

Dans cette vidéo, nous montrent comment utiliser une inductible, système lentiviral pour générer GFP-positives, pluripotentes à partir de cellules iPS FAE provenant de souris et de Oct4-GFP/R26-M2rtTA Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Cette procédure est une méthode utile pour générer des cellules iPS, car il permet le contrôle de l'expression du transgène pendant le processus de reprogrammation. Bien que l'utilisation de virus dans la génération de cellules iPS empêche l'utilisation de ces cellules dans un milieu clinique, cette procédure ne nous permettent de répondre à certaines des grandes questions biologiques qui sous-tendent le processus de reprogrammation encore défini.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G