Generare cellule iPS dal MEF attraverso l'espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Summary

Questo video mostra la procedura per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte con lentivirus inducibile che esprimono Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4.

Abstract

Pluripotenza può essere indotto in murini differenziati per trasduzione virale di Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc (Takahashi e Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Abbiamo ideato una strategia di riprogrammazione, in cui sono espressi questi quattro fattori di trascrizione da doxiciclina (dox)-inducibile vettori lentivirali (Brambrink et al., 2008). L'utilizzo di questi costrutti inducibili, possiamo derivare staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF). In questo video, dimostriamo la procedura per la generazione di lentivirus inducibile che esprimono i quattro fattori di trascrizione e mostrano come infettare MEF con questi virus al fine di produrre cellule iPS. Utilizzando lentivirus inducibile, l'espressione dei quattro fattori controllati con l'aggiunta di doxiciclina al mezzo di coltura. Il vantaggio di questo sistema oltre l'infezione retrovirale tradizionale è la capacità di trasformare i geni e disattivare in modo che la cinetica di riprogrammazione e di espressione genica possono essere analizzati in dettaglio.

Protocol

Fase 1:

Scongelare le 293 cellule e piastra per la produzione di lentivirus.

1. Preparare 9 ml di medium DMEM + in un tubo da 15 ml.
2. Rimuovere un flacone di 293 titoli congelati dal serbatoio di azoto liquido e mettere la fiala in un bagno d'acqua a 37 ° C fino maggior parte delle cellule (ma non tutti) sono scongelati.
3. Rimuovere le cellule dal flacone congelamento e posto nel tubo 15ml dal punto 1.
4. Centrifugare a 180g per 5 minuti, e poi scartare il surnatante.
5. Risospendere le cellule con 10 ml di terreno DMEM +, e trasferirli in un gelatina rivestita da 100 mm piatto. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore fino a quando sono 80-90% confluenti.
6. Passaggio delle 293 celle: lavare le cellule con PBS, aspirare il PBS e aggiungere 4 ml per 10 cm piatto dello 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubare per 1 min a 37 ° C.
7. Staccare le cellule dai piatti toccando, risospendere con 10 ml di DMEM + medio, e trasferirli in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 180g per 5 minuti, e aspirare il surnatante.
8. Aggiungere il volume appropriato di DMEM + medio, e rompere le cellule in una sospensione singola cella pipettando su e giù parecchie volte.
9. Contare il numero di cellule e regolare la concentrazione di 8x10 ⁵ cellule per ml con media FP.
10. Cellule seme a 8x10 ⁶ celle (10 ml) per 100 mm piatto di cultura, e incubare una notte a 37 ° C, 5% di CO _2.

Fase 2:

Trasfettare 293 cellule con lentivirus plasmidi e virus raccolta

1. Per ogni 10 cm piastra, utilizzare 10 mg di FUW-Teto-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc) dorsale lentivirus con 2.5ug di PMD-G e 7,5 mg di pPax2.
2. Mentre aliquoting i tre plasmidi in un tubo, consegnare 30μl di Fugene 6 reagenti di trasfezione in una seconda provetta contenente 500μl di DMEM senza siero e mescolare delicatamente con le dita toccando e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Aggiungere il mix di DNA goccia a goccia nella provetta Fugene 6/DMEM-containing, mescolare delicatamente toccando dito e incubare per 20 min.
4. Aggiungere il DNA / Fugene 6 gocce complesso nel piatto di 293, e incubare una notte a 37 ° C, 5% di CO _2.
5. La mattina dopo: Aspirare il reagente di trasfezione contenente medio, aggiungere 5 ml di terreno fresco cellule staminali, le cellule e il ritorno alla incubatrice.
6. A 48 ore e 72 ore dopo la trasfezione, raccogliere il terreno dalla 293 da parte utilizzando una siringa da 10 ml sterile monouso, filtrandola attraverso un filtro di 0,45 micron dimensioni dei pori di acetato di cellulosa, e il trasferimento in un tubo da 15 ml.
7. Concentrare il surnatante virus da ultracentrifugazione. Risospendere il pellet virus nel volume desiderato e fare amixture in parti uguali del supporto contenente Oct-3/4-,-Sox2, Klf4 e c-Myc-lentivirus.
8. Pur facendo il virus, preparare Oct4-neo/rtTA o Oct4-GFP/rtTA MEF (<passaggio 3) al 90% di confluenza in 10 cm di piatti (2x10 ⁶ cellule per piatto)
9. Aspirare il terreno di coltura e lavare con 10 ml di PBS.
10. Eliminare PBS, aggiungere 1 ml per piatto dello 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubare a 37 ° C per 10 min.
11. Aggiungere 9 ml di terreno di coltura, di sospendere le cellule a una singola cella, e trasferirli in un tubo da 15 ml.
12. Contare il numero di cellule, e regolare la concentrazione di 8x10 ⁴ cellule per ml. Trasferire 10 ml di sospensione cellulare (8x10 ⁵ celle) ad un piatto di 10 cm rivestito con gelatina. Incubare il piatto durante la notte a 37 ° C, 5% di CO _2.
13. Aspirare il terreno da un piatto fibroblasti, e aggiungere 10 ml di virus contenenti mezzo. Incubare le cellule da 4 ore a notte a 37 ° C, 5% di CO _2.
14. Dopo 24 aspirare il terreno da un piatto fibroblasti, e aggiungere 10 ml di terreno fresco delle cellule ES.
15. Sostituire regolarmente medio delle cellule ES con doxiciclina supporto contenente per avviare l'espressione dei quattro geni, in altre parole, avviare riprogrammazione.
16. Se si utilizza un Oct4 neo-reporter, poi avviare la sezione di droga in qualsiasi momento tra 6 e 9 giorni.
17. Cambia il medium ogni giorno fino le colonie sono abbastanza grande per essere prelevati. Colonie dovrebbe prima diventare visibili circa una settimana dopo l'inizio della riprogrammazione. Dovrebbero diventare abbastanza grande da essere ritirato intorno al giorno 20.

Fase 3:

Raccogliendo le colonie iPS

Il giorno prima raccolta:

1. Seed il numero richiesto di gelatina rivestite 24-pozzetti con γ-irradiati DR4 MEF

Picking cloni al giorno 1:

1. Avanzamento delle colonie sulle piastre 1-2 ore prima di prendere.
2. Aggiungere 15 ml di PBS per i pozzi di un V a fondo piatto da 96 pozzetti.
3. Lavare il piatto contenente le colonie di essere raccolti una volta con PBS e aggiungere 10 ml di PBS al piatto.
4. Scegli le colonie con le punte piccole pipetta 5μl (impostare il Pipetman P20 il 4 mL). Trasferimento di colonies ad un pozzo nel piatto da 96 pozzetti.
5. Aggiungere 20 ml di tripsina in ogni pozzetto utilizzando il multi-canale (12) pipetor. Pipettare su e giù per 3 volte. Incubare a 37 ° C per 4 minuti.
6. Aggiungere 100 l di media ES alle colonie trypsinized. Pipettare su e giù per 10 volte. Trasferimento 6 cloni in un momento dal piatto a 96 pozzetti a un 24-ben piatto con una punta in ogni altra posizione sulla pipetor 12 coperti.
7. Crescono le celle del 24-pozzetti a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore fino a raggiungere le cellule 80-90% confluenza, alimentazione quotidiana con media delle cellule ES. Cellule sarà probabilmente pronto per espandersi in 3-7 giorni.

Fase 4

1. Espansione di cellule iPS
   1. Aspirare il mezzo, e lavare le cellule con 1 ml di PBS.
   2. Rimuovere completamente PBS, aggiungere 0,1 ml di tripsina 0,25% / 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C per 10 min.
   3. Aggiungere 0,4 ml del mezzo ES e sospendere le cellule pipettando su e giù per la sospensione singola cellula.
   4. Trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto della piastra 6-bene, aggiungere 1,5 ml di mezzo di cellule ES, e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore fino a raggiungere le cellule 80-90% confluenza in 6 pozzetti. A questo punto, preparare congelate delle cellule, come segue.
2. Preparazione del magazzino freeze
   1. Aspirare il mezzo, e lavare le cellule con 2 ml di PBS.
   2. Rimuovere completamente PBS, aggiungere 0,5 ml di tripsina 0,25% / 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C per 10 min.
   3. Aggiungere 2 ml del mezzo ES e sospendere le cellule pipettando su e giù per la sospensione singola cellula.
   4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml, contare il numero di cellule e spin giù le cellule.
   5. Eliminare il surnatante, risospendere le cellule ES con il mezzo per la concentrazione a 2x10 ⁶ cellule per ml.
   6. Preparare 2 celle medie ES congelamento (20% di DMSO in ES media) e aliquota è al 0,5 ml per flaconcino.
   7. Trasferire 0,5 ml di sospensione cellulare di congelare fiale e mescolare delicatamente.
   8. Mettere le fiale in una cella-congelamento contenitore e tenerlo a -80 ° C per una notte, trasferimento di azoto liquido il giorno successivo per conservazione a lungo termine.

Discussion

In questo video ci dimostra come utilizzare un sistema inducibile lentivirali per generare GFP-positive, le cellule iPS da MEF pluripotenti derivate da topi e Oct4-GFP/R26-M2rtTA Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Questa procedura è un metodo utile per generare cellule iPS, perché permette il controllo di espressione del transgene durante il processo di riprogrammazione. Sebbene l'uso di virus nella generazione di cellule iPS impedisce l'uso di queste cellule in un ambiente clinico, questa procedura ci permette di rispondere ad alcune delle grandi questioni biologiche che sottolineano il processo di riprogrammazione ancora definito.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G