Generera iPS-celler från MEFS genom Forcerad Redovisning av Sox-2, oktober-4, c-Myc och Klf4

Summary

Denna video visar proceduren för att generera inducerade pluripotenta stamceller med hjälp av inducerbara lentivirus som uttrycker Oct4, Sox2, c-Myc och Klf4.

Abstract

Pluripotens kan induceras i differentieras murina av virala transduktion av Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc (Takahashi och Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Vi har utarbetat en omprogrammering strategi där dessa fyra transkriptionsfaktorer uttrycks från doxycyklin (dox)-inducerbara Lentiviral vektorer (Brambrink et al., 2008). Med hjälp av dessa inducible konstruktioner kan vi härleda inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler från möss embryonala fibroblaster (MEFs). I denna video visar vi förfarandet för generering av inducerbara lentiviruses som uttrycker de fyra transkriptionsfaktorer och visa hur man kan infektera MEFs med dessa virus för att ta fram iPS-celler. Genom att använda inducible lentiviruses, ett uttryck för de fyra faktorerna i kontrollerade genom tillsats av doxycyline till odlingsmediet. Fördelen med detta system har under den traditionella retrovirala infektionen är förmågan att vrida på och av gener så att kinetiken för omprogrammering och gen krav uttryck kan analyseras i detalj.

Protocol

Steg 1:

Tina upp 293 celler och plåt för lentivirus produktion.

1. Förbered 9 ml DMEM + medium i ett 15-ml tub.
2. Ta en flaska med fryst 293 aktier från den flytande kväve tanken och sätta flaskan i ett 37 ° C vattenbad tills det mesta (men inte alla) celler är tinat.
3. Avlägsna cellerna från att frysa flaskan och placera in i 15ml tub från steg 1.
4. Centrifugera vid 180 g i 5 minuter och sedan kassera supernatanten.
5. Resuspendera cellerna med 10 ml DMEM + medium, och överför till en gelatin-belagd 100-mm skålen. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator tills de är 80-90% konfluenta.
6. Passage av 293 celler: Tvätta cellerna med PBS, aspirera PBS och tillsätt 4 ml per 10-cm skål på 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, och inkubera i 1 minut vid 37 ° C.
7. Ta loss celler från rätter genom att knacka, resuspendera med 10 ml DMEM + medium, och överför till en 15-ml tub. Centrifugera vid 180 g i 5 minuter och aspirera supernatanten.
8. Lägg till lämplig volym av DMEM + medium och bryta upp cellerna i en enda cell fjädring genom att pipettera upp och ned flera gånger.
9. Räkna antalet celler och justera koncentrationen till 8x10 ⁵ celler per ml med FP medium.
10. Seed celler vid 8x10 ⁶ celler (10 ml) per 100-mm kultur maträtt, och inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO _2.

Steg 2:

Transfektera 293 celler med lentivirus plasmider och skörd virus

1. För varje 10-cm tallrik, användning 10 mikrogram FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 eller c-Myc) lentivirus stamnätet med 2.5ug av PMD-G och 7,5 mikrogram pPax2.
2. Medan alikvotering de tre plasmider i ett rör, leverera 30μl av Fugene 6 transfektion reagens i en andra tub innehåller 500μl av DMEM utan serum och blanda försiktigt med finger tapping och inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
3. Lägg till DNA mixen drop-by-drop in i Fugene 6/DMEM-containing röret, blanda försiktigt med finger tapping och inkubera i 20 min.
4. Lägg till DNA / Fugene 6 komplexa droppvis i skålen på 293-talet, och inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO _2.
5. Nästa morgon: Sug på transfektion reagens innehållande medium, tillsätt 5 ml rent ES-celler medium och tillbaka cellerna till inkubatorn.
6. På 48 timmar och 72 timmar efter transfektion, samla in mediet från 293-talet av med en 10-ml steril engångsspruta, filtrera den genom ett 0,45-ìm porstorlek cellulosaacetat filtrera och överföra till en 15-ml tub.
7. Koncentrera viruset supernatanten genom ultracentrifugering. Resuspendera viruset pelleten i önskad volym och göra amixture av lika delar av underlaget med Oct-3/4-, Sox2-, Klf4-och c-Myc-lentiviruses.
8. Samtidigt som viruset, förbereda Oct4-neo/rtTA eller Oct4-GFP/rtTA MEFs (passage <3) till 90% confluency i 10-cm rätter (2x10 ⁶ celler per fat)
9. Aspirera odlingsmedium och tvätta med 10 ml PBS.
10. Kassera PBS, tillsätt 1 ml per fat på 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
11. Tillsätt 9 ml av odlingsmedium, avbryta celler till en enda cell, och överför till en 15-ml tub.
12. Räkna antalet celler och justera koncentrationen till 8x10 ⁴ celler per ml. Överför 10 ml cellsuspension (8x10 ⁵ celler) till en 10-cm skål täckt med gelatin. Inkubera skålen över natten vid 37 ° C, 5% CO _2.
13. Sug mediet från en fibroblast skål, och tillsätt 10 ml av virus-innehållande medium. Inkubera cellerna från 4 timmar till över natten vid 37 ° C, 5% CO _2.
14. Efter 24 aspirera mediet från en fibroblast skål, och tillsätt 10 ml rent ES-celler medium.
15. Ersätta vanliga medelstora ES-celler med medium som innehåller doxycyklin att inleda uttrycket av de fyra generna, med andra ord, initiera omprogrammering.
16. Om du använder en Oct4-neo reporter, initiera sedan drog avsnitt som helst mellan 6 och 9 dagar.
17. Ändra på medellång varje dag tills samhällena blir stora nog att plockas upp. Kolonier bör först blir synliga cirka en vecka efter inledandet av omprogrammering. De bör vara tillräckligt stora för att plockas upp runt dag 20.

Steg 3:

Plocka upp IPS kolonierna

Dagen innan plocka:

1. Seed det nödvändiga antalet gelatin-belagd 24-brunnars plattor med γ-bestrålade DR4 MEFs

Plocka Kloner dag 1:

1. Mata kolonier på plattorna 1-2 timmar före plockning.
2. Tillsätt 15 l PBS till brunnar i en V-botten 96-bra maträtt.
3. Tvätta skålen innehåller kolonierna som ska plockas en gång med PBS och tillsätt 10 ml PBS i skålen.
4. Välj kolonierna med den lilla 5μl pipett tips (ange P20 pipetman den 4 l). Överföring colonies till en bra i 96-bra maträtt.
5. Tillsätt 20 l av trypsin till varje brunn med hjälp av flera kanaler (12) pipetor. Pipettera upp och ner tre gånger. Inkubera vid 37 ° C i 4 minuter.
6. Tillsätt 100 l av ES papper till trypsinized kolonierna. Pipettera upp och ner 10 gånger. Överföring 6 kloner i en tid från 96-bra maträtt till ett 24-bra maträtt med en spets på varje annan plats på 12 plats pipetor.
7. Odla cellerna i 24-brunnar i en 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator tills cellerna når 80-90% confluency, utfodring dagligen med ES-celler medium. Cellerna kommer förmodligen att vara redo att expandera i 3-7 dagar.

Steg 4

1. Utbyggnad av iPS-celler
   1. Aspirera på medellång och tvätta cellerna med 1 ml PBS.
   2. Ta bort PBS helt, tillsätt 0,1 ml 0,25% trypsin / 1 mM EDTA och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
   3. Tillsätt 0,4 ml av ES mediet och suspendera cellerna genom att pipettera upp och ner till enskild cell suspension.
   4. Överför cellsuspension till en väl av 6-brunnar, tillsätt 1,5 ml medelstora ES-celler, och inkubera i 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator tills cellerna når 80-90% confluency i 6-brunnars plattor. Vid denna punkt, förbereda frysta lager av celler, enligt följande.
2. Beredning av frysa lager
   1. Aspirera på medellång och tvätta cellerna med 2 ml PBS.
   2. Ta bort PBS helt, tillsätt 0,5 ml 0,25% trypsin / 1 mM EDTA och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
   3. Tillsätt 2 ml av ES mediet och suspendera cellerna genom att pipettera upp och ner till enskild cell suspension.
   4. Överför cellsuspension till en 15-ml tub, räkna antalet celler och spinn ner cellerna.
   5. Kasta bort vätskefasen, resuspendera celler med ES medium till koncentrationen vid 2x10 ⁶ celler per ml.
   6. Förbered 2 ES medelstora cell frysning (20% DMSO i ES medium) och alikvot den 0,5 ml per flaska.
   7. Överför 0,5 ml av cellsuspensionen att frysa flaskorna och blanda försiktigt.
   8. Ställ flaskorna i en cell-frysning behållaren och håll den vid -80 ° C över natten, överföring till flytande kväve nästa dag för långsiktig lagring.

Discussion

I denna video visar vi hur man använder en inducible, Lentiviral systemet att generera GFP-positiva, pluripotenta iPS-celler från MEFs från Oct4-GFP/R26-M2rtTA och Nanog-GFP/R26-M2rtTA möss. Detta förfarande är en användbar metod för att generera iPS-celler, eftersom det möjliggör kontroll av transgenen uttryck under omprogrammering processen. Även om användningen av virus i generationen av iPS-celler hämmar användningen av dessa celler i en klinisk miljö, gör det möjligt detta förfarande oss att besvara några av de viktigaste biologiska frågor som understryker ännu inte definierad omprogrammering process.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G