יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

Summary

וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

Abstract

Pluripotency יכול להיגרם על Murine מובחן על ידי התמרה ויראלית של Oct4, Sox2, Klf4, ו c-myc (טקהאשי ו יאמאנאקה, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). אנחנו פיתחו אסטרטגיה reprogramming שבו אלה גורמי תעתוק ארבעה הביעו מן דוקסיציקלין (DOX), ועין מתנהלת וקטורים lentiviral (Brambrink et al. 2008). באמצעות אלה בונה ועין מתנהלת, אנחנו יכולים להפיק המושרה גזע pluripotent (IPS) של תאים עובריים של עכבר fibroblasts (MEFs). בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליך עבור הדור של lentiviruses ועין מתנהלת המבטאים את ארבעת גורמי תעתוק ולהראות כיצד להדביק MEFs עם וירוסים אלה כדי לייצר תאים iPS. באמצעות lentiviruses ועין מתנהלת, את הביטוי של ארבעת הגורמים מבוקרים על ידי תוספת של doxycyline עד בינוני התרבות. יתרונה של מערכת זו על הזיהום retroviral המסורתי הוא היכולת להפוך את הגנים לסירוגין כך קינטיקה של תכנות מחדש וביטוי דרישות הגן ניתן לנתח בפירוט.

Protocol

שלב 1:

להפשיר 293 תאים צלחת לייצור lentivirus.

1. הכן 9 מ"ל של מדיום + DMEM בצינור 15 מ"ל.
2. הסר בקבוקון של 293 מניות קפוא מהטנק חנקן נוזלי ולשים את הבקבוקון בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס עד התאים ביותר (אך לא כולם) הם הפשירו.
3. הסרת תאים מבקבוקון מקום מקפיא לשפופרת 15 מ"ל של שלב 1.
4. צנטריפוגה ב 180g במשך 5 דקות, ולאחר מכן למחוק את supernatant.
5. Resuspend התאים עם 10 מ"ל של מדיום + DMEM, ולהעביר לצלחת 100 מ"מ מצופה ג'לטין. דגירה התאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור עד שהם ומחוברות 80-90%.
6. המעבר של 293 תאים: תאים לשטוף עם PBS, לשאוב PBS, ולהוסיף 4 מ"ל לכל צלחת 10 ס"מ של 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA, ו דגירה דקות 1 ב 37 ° C.
7. ניתוק תאים מנות ידי הקשה, resuspend עם 10 מ"ל DMEM + בינוני להעביר צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 180g במשך 5 דקות, ואת לשאוב supernatant.
8. הוספת נפח מתאים של DMEM + בינוני לשבור את התאים לתוך ההשעיה תא בודד על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
9. ספירת התאים ולהתאים את הריכוז ⁵ תאים לכל 8x10 מ"ל עם מדיום FP.
10. זרעים תאים ב ⁶ תאים 8x10 (10 מ"ל) לכל צלחת 100 מ"מ תרבות, דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

שלב 2:

Transfect 293 תאים עם פלסמידים lentivirus וירוס קציר

1. עבור צלחת 10 ס"מ כל אחת, להשתמש 10 מיקרוגרם של FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 או c-myc) עמוד השדרה lentivirus עם 2.5ug של PMD-G ו - 7.5 מיקרוגרם של pPax2.
2. בעוד aliquoting שלושה פלסמידים לתוך צינור, לספק 30μl של מגיב 6 transfection Fugene לתוך צינור שנייה המכיל 500μl של DMEM ללא נסיוב ומערבבים בעדינות אצבע על ידי הקשה ואת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מוסיפים את תערובת ה-DNA טיפה אחר טיפה לתוך הצינור Fugene 6/DMEM-containing, לערבב בעדינות על ידי הקשה אצבע דגירה של 20 דקות.
4. מוסיפים את ה-DNA / 6 Fugene dropwise מורכב לתוך צלחת של 293 של ו דגירה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO _2.
5. למחרת בבוקר: לשאוב transfection מגיב המכילים בינוני, מוסיפים 5 מ"ל של מדיום ES טרי התא, ולהחזיר את התאים אל האינקובטור.
6. ב 48 שעות ו 72 שעות לאחר transfection, לאסוף את המדיום של 293 זה באמצעות מזרק חד פעמי של 10 מ"ל סטרילי, סינון זה באמצעות 0.45-מיקרומטר גודל מסנן נקבוביות צלולוזה אצטט, והעברת לשפופרת 15 מ"ל.
7. לרכז את supernatant וירוס על ידי ultracentrifugation. Resuspend גלולה וירוס בנפח הרצוי ולעשות amixture של חלקים שווים של המדיום המכיל Oct-3/4-, Sox2-, Klf4 ו-c-myc-lentiviruses.
8. אמנם עושה את הנגיף, או להכין Oct4-neo/rtTA Oct4-GFP/rtTA MEFs (מעבר <3) 90% confluency ב 10 ס"מ מנות (2x10 ⁶ תאים לכל מנה)
9. לשאוב את המדיום תרבות לשטוף עם 10 מ"ל של PBS.
10. בטל PBS, להוסיף 1 מ"ל לכל צלחת של 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
11. הוסף 9 מ"ל של המדיום תרבות, להשעות את התאים לתא אחד, להעביר צינור 15 מ"ל.
12. ספירת תאים, ולהתאים את הריכוז ⁴ תאים 8x10 לכל מ"ל. העברת 10 מ"ל של השעיה תא (8x10 ⁵ תאים) על צלחת בגודל 10 ס"מ מצופה ג'לטין. דגירה את המנה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO _2.
13. לשאוב את המדיום מתוך קערה פיברובלסטים, ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום וירוס המכיל את. דגירה תאים 4 שעות עד לילה בשעה 37 ° C, 5% CO _2.
14. אחרי 24 לשאוב את המדיום מתוך קערה פיברובלסטים, ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום ES טרי התא.
15. החלף בינוני קבוע תא ES עם דוקסיציקלין בינוני המכיל ליזום את הביטוי של ארבעת הגנים, או במילים אחרות, ליזום תכנות מחדש.
16. אם באמצעות כתב Oct4, ניאו, אז ליזום סעיף התרופה בכל עת בין 6 ל 9 ימים.
17. שנה את בינונית בכל יום עד המושבות להיות גדול מספיק כדי להיות נטל. מושבות צריך קודם להיות גלוי כשבוע לאחר תחילת של תכנות מחדש. הם צריכים להיות גדולים מספיק כדי להיות הרים סביב יום 20.

שלב 3:

הרמת מושבות iPS

יום לפני קטיף:

1. Seed את המספר הדרוש של ג'לטין מצופה 24 גם צלחות עם γ-מוקרן DR4 MEFs

בחירת המשובטים על יום 1:

1. פיד המושבות על הצלחות 1-2 שעות לפני קטיף.
2. הוסף 15 μl של PBS על הבארות של צלחת תחתית ה-V-96-היטב.
3. לשטוף את צלחת המכילה מושבות להיות נטל פעם אחת עם PBS ולהוסיף 10ml של PBS על המנה.
4. בחר את מושבות עם טיפים קטנים pipet 5μl (להגדיר את pipetman P20 על μl 4). העברת שיתוףlonies לבאר בצלחת 96-היטב.
5. הוסף 20 μl של טריפסין זה גם שימוש מרובה ערוצים (12) pipetor. Pipet למעלה ולמטה 3 פעמים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
6. הוסף 100 μl של המדיום ES למושבות trypsinized. Pipet למעלה ולמטה 10 פעמים. העברת 6 שיבוטים בכל פעם מצלחת 96-היטב צלחת 24 גם באמצעות טיפ במיקום כל האחרים pipetor 12 את המקום.
7. לגדל את התאים על צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור עד שהתאים מגיעים 80-90% confluency, האכלה יומית עם המדיום הסלולרי ES. תאים כנראה יהיה מוכן להרחיב על 3-7 ימים.

שלב 4

1. הרחבת תאים iPS
   1. לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS.
   2. הסר PBS לחלוטין, להוסיף 0.1 מ"ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   3. הוסף 0.4 מ"ל של המדיום ES ו להשעות את התאים על ידי pipetting מעלה ומטה כדי השעיה תא בודד.
   4. מעבירים את ההשעיה התא היטב של צלחת 6-היטב, להוסיף 1.5 ES מ"ל בינוני התא דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור לתאים להגיע עד 80-90% confluency ב 6 גם הצלחות. בשלב זה, להכין מלאי קפוא של התאים, כדלקמן.
2. הכנת מלאי להקפיא
   1. לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים של 2 מ"ל PBS.
   2. הסר PBS לחלוטין, להוסיף 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   3. הוסף 2 מ"ל של המדיום ES ו להשעות את התאים על ידי pipetting מעלה ומטה כדי השעיה תא בודד.
   4. מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל, לספור את מספר התאים ספין מטה את התאים.
   5. בטל supernatant, resuspend את התאים בינוני ES לריכוז בבית 2x10 ⁶ תאים לכל מיליליטר.
   6. הכן 2 תא הקפאה ES בינוני (DMSO 20% ES בינוני) ו aliquot אותו 0.5 מ"ל לכל מבחנה.
   7. העברת 0.5 מ"ל של ההשעיה תא להקפיא צלוחיות ומערבבים בעדינות.
   8. שימו את צלוחיות במיכל תא הקפאה ולשמור אותו -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה; להעביר חנקן נוזלי למחרת לאחסון ארוך טווח.

Discussion

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להשתמש, ועין מתנהלת מערכת lentiviral ליצור GFP חיובי, iPS תאים pluripotent מ MEFs נגזר עכברים Oct4-GFP/R26-M2rtTA ו Nanog-GFP/R26-M2rtTA. פרוצדורה זו היא שיטה יעילה להפקת תאים iPS כי זה מאפשר לשלוט על הביטוי transgene במהלך תהליך תכנות מחדש. למרות השימוש של וירוסים בדור של תאים iPS מונעת את השימוש של תאים אלה בסביבה קלינית, הליך זה מאפשר לנו לענות על כמה שאלות ביולוגיות העיקריים להדגיש את תהליך תכנות מחדש מוגדר עדיין.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G