La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

Summary

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

Abstract

Pluripotencia puede ser inducida en murino diferenciados por la transducción viral de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Hemos diseñado una estrategia de reprogramación en el que estos cuatro factores de transcripción se expresan de doxiciclina (Dox)-inducible vectores lentivirus (Brambrink et al., 2008). El uso de estas construcciones inducible, se puede derivar células madre pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). En este vídeo, que muestran el procedimiento para la generación de los lentivirus inducible que expresan los cuatro factores de transcripción y muestran cómo infectar MEFs con estos virus con el fin de producir células iPS. Mediante el uso de los lentivirus inducible, la expresión de los cuatro factores en el control de la adición de doxiciclina al medio de cultivo. La ventaja de este sistema a través de la infección retroviral tradicional es la capacidad de convertir los genes dentro y fuera de lo que la cinética de la reprogramación y las necesidades de expresión de genes puede ser analizado en detalle.

Protocol

Paso 1:

Descongelar 293 células y la placa para la producción de lentivirus.

1. Prepare 9 ml de medio DMEM + en un tubo de 15 ml.
2. Eliminar un vial de 293 acciones congeladas desde el tanque de nitrógeno líquido y poner el frasco en un baño de agua a 37 ° C hasta su mayoría de las células (pero no todos) se descongelan.
3. Eliminar las células de la ampolla de congelación y el lugar en el tubo de 15 ml en el paso 1.
4. Centrifugar a 180 g por 5 min, y luego descartar el sobrenadante.
5. Resuspender las células con 10 ml de medio DMEM +, y la transferencia de una gelatina con cubierta de 100 mm plato. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora hasta que el 80-90% confluente.
6. La aprobación de la 293 células: las células de lavado con PBS, aspirar el PBS y añadir 4 ml por cada 10 cm plato de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA y se incuba durante 1 min a 37 ° C.
7. Separar las células de los platos a la grabación, resuspender con 10 ml de DMEM + medio, y transferir a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 g por 5 min, y aspirar el sobrenadante.
8. Añadir un volumen adecuado de DMEM + medio, y se rompen las células en una suspensión de células individuales pipeteando arriba y abajo varias veces.
9. Cuente el número de células y ajustar la concentración de 8x10 ⁵ células por ml con medio FP.
10. Las células de las semillas a 8x10 ⁶ células (10 ml) por placa de cultivo de 100 mm, y se incuba durante la noche a 37 ° C, 5% de CO _2.

Paso 2:

Transfectar 293 células con plásmidos lentivirus y virus de la cosecha

1. Por cada placa de 10 cm, el uso de 10 mg FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), columna vertebral de lentivirus con 2.5ug del PMD-G y 7,5 g de pPax2.
2. Mientras que los tres plásmidos alícuotas en un tubo, entregar 30μl de reactivo de transfección Fugene 6 en un segundo tubo que contiene 500μl del DMEM sin suero y mezclar suavemente con el dedo tocando e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Añadir la mezcla de ADN gota a gota en el tubo Fugene 6/DMEM-containing, mezclar suavemente tocando los dedos y se incuba durante 20 min.
4. Añadir el ADN / Fugene 6 gota a gota complejo en el plato de 293, y se incuban durante la noche a 37 ° C, 5% de CO _2.
5. A la mañana siguiente: Aspirar el reactivo de transfección medio que contiene, añadir 5 ml de medio fresco de células ES, y volver a las células a la incubadora.
6. A las 48 horas y 72 horas después de la transfección, recoge el medio de la 293 mediante el uso de un niño de 10 ml jeringa desechable estéril, filtrándola a través de un filtro de poro de 0,45 micras de tamaño de acetato de celulosa, y la transferencia en un tubo de 15 ml.
7. Concentrar el sobrenadante del virus por ultracentrifugación. Resuspender el precipitado virus en el volumen deseado y hacer amixture de partes iguales del soporte de Oct-3/4-, Sox2, Klf4 y c-Myc-lentivirus.
8. Al tiempo que el virus, o preparar Oct4-neo/rtTA MEFs Oct4-GFP/rtTA (paso <3) y el 90% de confluencia en los platos de 10 cm (2x10 ⁶ células por placa)
9. Aspirar el medio de cultivo y lavar con 10 ml de PBS.
10. Deseche PBS, añadir 1 ml por placa de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA y se incuba a 37 ° C durante 10 min.
11. Añadir 9 ml del medio de cultivo, suspender las células en una sola célula, y transferir a un tubo de 15 ml.
12. Cuente el número de células, y ajustar la concentración de 8x10 ⁴ células por ml. Transferir 10 ml de suspensión celular (8x10 ⁵ células) a un plato de 10 cm recubiertas con gelatina. Incubar el plato de la noche a 37 ° C, 5% de CO _2.
13. Aspirar el medio de un plato de fibroblastos, y agregar 10 ml de medio que contiene el virus. Se incuban las células a partir de 4 h de la noche a 37 ° C, 5% de CO _2.
14. Después de 24 aspirar el medio de un plato de fibroblastos, y agregar 10 ml de medio fresco de células ES.
15. Vuelva a colocar medio normal de células ES con un medio que contiene doxiciclina para iniciar la expresión de los cuatro genes, es decir, iniciar la reprogramación.
16. Si se utiliza un reportero Oct4-neo, a continuación, iniciar la sección de drogas en cualquier momento entre 6 y 9 días.
17. Cambiar el medio de todos los días hasta que las colonias se lo suficientemente grande como para ser recogidos. Primeras colonias que se hacen visibles aproximadamente una semana después del inicio de la reprogramación. Deben ser lo suficientemente grande como para ser recogidos alrededor del día 20.

Paso 3:

Recogiendo las colonias iPS

El día antes de contestar:

1. Semilla de la cantidad necesaria de gelatina con cubierta 24 y placas con γ-irradiados DR4 MEFs

Recogiendo clones en el Día 1:

1. Alimentar a las colonias en las placas de 1-2 horas antes de la cosecha.
2. Añadir 15 l de PBS en los pocillos de una placa de fondo en V de 96 pozos.
3. Lave el recipiente que contenga las colonias para ser recogidos una vez con PBS y añadir 10 ml de PBS para el plato.
4. Elige las colonias con las puntas de pipeta pequeña 5μl (establecer el Pipetman P20, el 4 de l). La transferencia de colonies a un pozo en el plato de 96 pozos.
5. Añadir 20 l de tripsina a cada pocillo utilizando el multi-canal (12) pipetor. Pipeta de arriba a abajo 3 veces. Se incuba a 37 ° C durante 4 minutos.
6. Añadir 100 ml de medio de ES a las colonias con tripsina. Pipeta de arriba y abajo 10 veces. La transferencia de 6 clones en un momento en el plato de 96 pozos a un plato de 24 pozos con una punta en cualquier otra posición en el pipetor lugar 12.
7. Crecer las células en la placa de 24 pocillos en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora hasta que las células llegar a 80-90% de confluencia, la alimentación diaria con el medio de células ES. Las células probablemente estará lista para expandirse en 3-7 días.

Paso 4

1. Expansión de las células iPS
   1. Aspirar el medio, y se lavan las células con 1 ml de PBS.
   2. Eliminar por completo PBS, añadir 0,1 ml de tripsina 0,25% / 1 mM EDTA y se incuba a 37 ° C durante 10 min.
   3. Añadir 0,4 ml del medio de ES y suspender las células pipeteando arriba y abajo a la suspensión de células individuales.
   4. La transferencia de la suspensión celular a un pocillo de placa de 6 pocillos, agregar 1,5 ml de medio de células ES, y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora hasta que las células alcanzan el 80-90% de confluencia en placas de 6 pocillos. En este punto, preparar acciones congeladas de las células, de la siguiente manera.
2. Preparación de las acciones congelar
   1. Aspirar el medio, y se lavan las células con 2 ml de PBS.
   2. Eliminar por completo PBS, se añaden 0,5 ml de tripsina 0,25% / 1 mM EDTA y se incuba a 37 ° C durante 10 min.
   3. Añadir 2 ml del medio de ES y suspender las células pipeteando arriba y abajo a la suspensión de células individuales.
   4. La transferencia de la suspensión de células a un tubo de 15 ml, cuente el número de células y centrifugar las células.
   5. Descartar el sobrenadante, resuspender las células con medio ES a la concentración en 2x10 ⁶ células por ml.
   6. Prepare dos células ES medio de congelación (20% DMSO en medio ES) y la alícuota es de 0,5 ml por vial.
   7. La transferencia de 0,5 ml de la suspensión celular para congelar los viales y mezcle suavemente.
   8. Ponga los viales en un contenedor de congelación de células y mantener a -80 ° C durante la noche, la transferencia a nitrógeno líquido al día siguiente para almacenamiento a largo plazo.

Discussion

En este video, que muestra cómo utilizar un inducible, un sistema para generar lentiviral GFP-positivo, las células iPS pluripotentes a partir de MEFs derivados de ratones Oct4-GFP/R26-M2rtTA y Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Este procedimiento es un método útil para la generación de células iPS, ya que permite el control de la expresión del transgen durante el proceso de reprogramación. Aunque el uso de virus en la generación de células iPS impide el uso de estas células en un entorno clínico, este procedimiento nos permite responder a algunas de las principales cuestiones biológicas que subrayan el proceso de reprogramación aún no definida.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G