Summary
このビデオでは、誘導レンチウイルスを用いて誘導多能性幹細胞を生成するための手順を示して発現するOct4は、レトロウイルスベクター、c - MycおよびKLF4。
Abstract
多能性は、Oct4のウイルスの形質導入により差別化されたマウスで誘導することができる、レトロウイルスベクター、KLF4、およびc - Myc（高橋と山中、2006; Wernig、ら、2007;。沖田ら、2007;。。Maherali、ら、 2007年）。我々は、これら4つの転写因子は、ドキシサイクリン（DOX）から発現されるプログラミング戦略を考案したレンチウイルスベクターを（Brambrinkら、2008）誘導。これらの誘導の構文を使用して、我々はマウス胚性繊維芽細胞（MEF）から誘導多能性幹（iPS）細胞を得ることができます。このビデオでは、我々は4つの転写因子を発現し、iPS細胞を生成するためにこれらのウイルスとMEFのを感染させる方法を示す誘導レンチウイルスを生成するための手順を示しています。誘導レンチウイルスを使用することにより、培地にdoxycylineを追加することにより制御の4つの因子の発現。従来のレトロウイルス感染に対するこのシステムの利点は、プログラミングと遺伝子発現の要件の動態を詳細に分析できるようにオフの遺伝子をオンとする機能です。
Protocol
ステップ1：
レンチウイルスの生産のための293細胞とプレートを解凍。
- 15 mlのチューブにDMEM +培地9mlのを準備します。
- 液体窒素タンクから凍結293株のバイアルを取り出して、（すべてではない）ほとんどの細胞が融解するまで37℃の水浴中にバイアルを入れて。
- ステップ1から15ミリリットルチューブに凍結バイアルと場所から細胞を取り除きます。
- 5分間180グラムで遠心分離し、上清を捨てる。
- DMEM +培地10 mlで細胞を再懸濁し、そしてゼラチンでコーティングされた100 mmディッシュに移す。彼らは80〜90％コンフルエントになるまで37℃、5％CO 2インキュベーターで細胞をインキュベートする。
- 293細胞の継代：PBSで洗浄細胞、PBSを吸引除去、および0.05％trypsin/0.53 mMのEDTAの10cmの皿あたり4 mlを追加し、37℃で1分間インキュベート℃に
- 10ミリリットルDMEM +培地で再懸濁し、タップして皿から細胞を剥離し、15 mlのチューブに移す。 5分間180グラムで遠心分離し、上清を吸引除去する。
- DMEM +培地の適切な量を追加し、数回上下にピペッティングして、単一の細胞懸濁液に細胞を壊す。
- セルの数をカウントし、FPの培地でmlあたり8 × 10 5細胞に濃度を調整する。
- 種子の100 mm培養ディッシュあたり8 × 10 6個の細胞（10 ml）で、細胞、および37℃で一晩インキュベート° C、5％CO 2。
ステップ2：
レンチウイルスプラスミドと収穫のウイルスを293細胞にトランスフェクション
- 各10cmのプレートの場合は、FUW -テト- cDNAの10μgの（Oct4の、レトロウイルスベクター、KLF4またはc - Mycの）PMD - Gの2.5ugとレンチウイルスのバックボーンとpPax2の7.5μgを使用してください。
- チューブに3つのプラスミドを小分けしながら、血清を含まないDMEMの500μLを含む第2のチューブにFuGENE 6トランスフェクション試薬の30μlのを提供し、室温で5分間指のタッピングとインキュベートすることにより穏やかに混合する。
- DNA混合物をトランスフェ6/DMEM-containingチューブにドロップでドロップを追加し、20分間、指のタッピングとインキュベートすることにより穏やかに混合する。
- 293のの皿にDNA /のFugene 6複雑な滴下を追加し、37℃で一晩インキュベート° C、5％CO 2。
- 翌朝：トランスフェクション試薬を含む培地を吸引、新鮮なES細胞培地5mlを追加し、インキュベーターにセルを返します。
- 48時間とトランスフェクション後72時間で、0.45μmのポアサイズの酢酸セルロースフィルターを通してそれをフィルタリング、および15 mlのチューブに移し、10 mlの滅菌使い捨て注射器を使って、293年代から培地を収集する。
- 超遠心分離によりウイルスの上清を集中する。目的のボリュームにウイルスペレットを再懸濁し、Oct-3/4-、Sox2の - 、KLF4 -およびc - Myc -レンチウイルスを含む培地の等量のamixtureを行います。
- ウイルスを作成しているときに、10cmの皿（皿あたり2 × 10 6細胞）でコンフルエント90％にOct4-neo/rtTAまたはOct4-GFP/rtTA MEFSを（通路<3）の準備
- 培地を吸引除去し、PBSの10mlで洗う。
- 0.05パーセントtrypsin/0.53 mMのEDTAのディッシュあたり1 mlを追加し、37℃で10分間、PBSを捨てます。
- 培地9mlのを追加し、単一のセルにセルを一時停止し、15 mlのチューブに移す。
- セルの数をカウントし、mlあたり8 × 10 4個の細胞に濃度を調整する。ゼラチンでコーティングした10cmのディッシュに細胞懸濁液10ml（8 × 10 5細胞）を移します。一晩37皿をインキュベート° C、5％CO 2。
- 線維芽細胞のディッシュから培地を吸引し、そしてウイルスを含む培地10mlを加え。 4時間から37℃で一晩に、細胞をインキュベート° C、5％CO 2を 。
- 24時間後線維芽細胞のディッシュから培地を吸引除去し、新鮮なES細胞用培地10mlを加え。
- 4つの遺伝子の発現を開始するためにドキシサイクリンを含む培地で、通常のES細胞用培地を交換し、他の言葉で、再プログラミング開始。
- Oct4は、ネオレポーターを使用している場合は、6と9日の間いつでも薬剤のセクションを開始する。
- コロニーをピックアップするのに十分な大きさになるまで、毎日培地を変更します。コロニーは、最初のプログラミングの開始後約週見えるようになります。彼らは20日目の周りにピックアップされるのに十分な大きさになるはず。
ステップ3：
iPS細胞コロニーをピックアップ
ピッキング前日：
- γ線照射DR4 MEFの持つゼラチンコートした24ウェルプレートを必要な数の種子
1日目のクローンをピッキング。
- 1〜2時間取る前プレート上のコロニーを養う。
- V底96ウェルディッシュのウェルにPBS 15μlを添加する。
- PBSで一度ピックアップし、皿にPBS 10mlのを追加するコロニーを含む皿を洗ってください。
- 小さな5μlのピペットチップ（4μlのP20 pipetmanを設定）を使用してコロニーを選択してください。転送CO96ウェルディッシュにもへロニーズ。
- よくマルチチャンネル（12）pipetorを使用してそれぞれにトリプシンを20μlを添加する。ピペッティング3回。 37℃で4分間。
- トリプシン処理コロニーにES培地100μlを加え。ピペッティング10回。 12位pipetor上の他のすべての位置にチップを用いて24ウェルディッシュに96ウェルディッシュから一度に6個のクローンを転送します。
- 細胞はES細胞用培地を毎日供給、80〜90％コンフルエントに達するまで、37 ° C、5％CO 2インキュベーター内で24ウェルプレート上で細胞を成長させる。細胞は、おそらく3-7日で拡大できるようになります。
ステップ4
- iPS細胞の拡大
- 培地を吸引除去し、1mlのPBSで細胞を洗浄する。
- 完全にPBSを除去、37℃で0.25％トリプシン/ 1mMのEDTAとインキュベート0.1 mlを加える℃で10分間。
- ES培地0.4 mlを加え、単一の細胞懸濁液にピペッティングにより細胞を一時停止。
- 6ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液を転送、1.5 mlのES細胞用培地を追加し、そして細胞は6ウェルプレートでコンフルエント80〜90％に達するまで37℃、5％CO 2インキュベーター中でインキュベートする。この時点で、次のように、細胞の凍結ストックを準備。
- 凍結ストックの調製
- 培地を吸引し、PBS 2mlで細胞を洗浄する。
- 完全にPBSを除去、37℃で0.25％トリプシン/ 1mMのEDTAとインキュベートの0.5 mlを加える℃で10分間。
- ES培地2 mlを加え、単一の細胞懸濁液にピペッティングにより細胞を一時停止。
- 15 mlのチューブに細胞懸濁液を転送する、セルの数をカウントし、細胞をスピンダウン。
- 、上清を捨てmlあたり2 × 10 6個の細胞で濃度にES培地で細胞を懸濁します。
- 2 ES細胞の凍結培地（ES培地で20％のDMSO）とバイアル当たり0.5 mlのアリコートを、それを準備する。
- バイアルを凍結し、穏やかに混合して細胞懸濁液0.5 mlを移します。
- 液体窒素に転送する長期保存のための次の日、細胞凍結容器にバイアルを入れ、-80、それを維持℃で一晩。
Discussion
このビデオでは、我々はOct4-GFP/R26-M2rtTAとNanog-GFP/R26-M2rtTAマウス由来のMEFからのGFP陽性、多能性iPS細胞を生成するために誘導、レンチウイルスシステムを使用する方法を示します。それはプログラミングプロセス中に導入遺伝子発現の制御が可能なため、この手順では、iPS細胞を生成するための有用な方法です。 iPS細胞の発生におけるウイルスの使用が臨床の現場でこれらの細胞の使用を妨げるが、この手順は、私たちはまだ定義されている更新プロセスを下線主要な生物学的な疑問の幾つかに解答したりすることができます。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Reagent | Sigma-Aldrich | D9891-100G |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Maherali, N., et al. Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
