Summary
该视频显示程序生成诱导多能干细胞诱导慢病毒表达OCT4，SOX2，c - Myc和KLF4。
Abstract
多能性，可以被诱导分化小鼠Oct4的病毒转导，SOX2，KLF4和c - Myc（Takahashi和Yamanaka，2006年; Wernig等人，2007年，大来，等，2007;。Maherali，等， 2007年）。我们已制定了一个重新编程的战略，这四个转录因子的表达强力霉素（DOX）诱导慢病毒载体（Brambrink等，2008）。使用这些诱导结构，我们可以推导出诱导多能干细胞（iPS）细胞从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。在这段视频中，我们展示了诱导慢病毒表达四个转录因子，并展示如何用这些病毒感染MEFs中，以产生iPS细胞的生成过程。通过使用诱导慢病毒，四个doxycyline此外培养基控制因素的表达。该系统比传统的逆转录病毒感染的优势是能够打开和关闭基因，使重新编程和基因表达的要求的动力学进行详细分析。
Protocol
第1步：
解冻293细胞的慢病毒生产和板。
- 准备在15毫升管9毫升的DMEM +中。
- 从液氮罐中取出一小瓶冷冻293股，并在37℃水浴小瓶，直到大多数（但不是所有）的细胞解冻。
- 从第1步15毫升管取出细胞冷冻小瓶和地方。
- 在180克离心5分钟，然后弃去上清液。
- 10毫升的DMEM +中重悬细胞，并转移到一个明胶包100毫米盘。在37℃，5％的CO 2培养箱中孵育，直到他们80-90％融合的细胞。
- 293细胞中的一段话：用PBS洗细胞，吸出PBS，并添加4毫升，每10厘米0.05％trypsin/0.53 mM EDTA的菜，和孵育1分钟，在37 ° C。
- 分离细胞从菜敲击，用10 ml的DMEM +中悬浮，并转移至15毫升管。在180克离心5分钟，吸出上清液。
- 添加适当体积的DMEM +培养基，吹打向上和向下几次分手成单细胞悬液的细胞。
- 计数的细胞数量，并调整浓度为8 × 10 5细胞每毫升与FP介质。
- 8x10的6个细胞，每100毫米培养皿（10毫升）的种子细胞，孵育37℃过夜℃，5％的CO 2。
第2步：
慢病毒质粒和收获病毒的转染293细胞
- 对于每一个10厘米的板，使用10微克的FUW tetO基因（OCT4，SOX2，KLF4和c - Myc基因）与PMD - G 2.5ug的慢病毒的骨干和7.5微克pPax2。
- 虽然aliquoting成筒3种质粒，提供Fugene 6转染试剂30μl不含血清的DMEM500μL成为第二个管和混合攻手指和孵化轻轻地在室温下5分钟。
- 新增的DNA组合到Fugene 6/DMEM-containing管降落，轻轻混匀手指敲击和20分钟的孵育。
- DNA / Fugene 6复杂滴加添加到293的菜，孵育过夜，于37℃，5％的CO 2。
- 第二天早上，吸出转染试剂，培养基，添加5毫升的新鲜胚胎干细胞的培养基，细胞返回到孵化器。
- 在转染后48小时和72小时，收集从293中使用了10毫升的一次性无菌注射器，它通过一个0.45微米孔径的醋酸纤维素过滤器过滤，并转移到15毫升管。
- 超速离心浓缩病毒上清。重悬在病毒颗粒所需的量和平等的介质，含Oct-3/4-，Sox2基因的，KLF4和c - Myc的慢病毒amixture。
- 同时使病毒，准备在10厘米的菜肴Oct4-neo/rtTA或Oct4-GFP/rtTA MEFs（通过<3）至90％汇合（2 × 10 6细胞每道菜）
- 吸用10毫升的PBS的培养液和清洗。
- 倒掉PBS中，添加1毫升每碟0.05％trypsin/0.53 mM的EDTA，37 ° 10分钟。
- 加入9毫升培养液，暂停一个单细胞的细胞，然后转移到一个15毫升管。
- 计数的细胞数量，并调整浓度为每毫升8x10的4细胞。 10 ml的细胞悬液（8 × 10 5细胞）转移到10厘米的菜涂用明胶。菜隔夜在37℃，5％的CO 2。
- 从成纤维细胞菜吸培养基，添加10毫升的含有病毒的媒介。孵育4小时通宵细胞在37℃，5％的CO 2。
- 24后吸出从成纤维细胞菜的培养基，添加10毫升的新鲜胚胎干细胞的培养基。
- 定期ES细胞培养基更换培养基中含有强力霉素启动的四个基因的表达，换句话说，启动重新编程。
- 如果使用一个Oct4的新记者，然后启动随时药物的第6和第9天之间。
- 更改媒体每天的殖民地，直到变得足够大，被拾起。殖民地首先应该成为可见约一周后开始重整。他们应该变得足够大，要20天左右采摘。
第3步：
撑起的iPS殖民地
采摘前的一天：
- 种子明胶包被的24孔板所需数量与γ辐照DR4的MEFs
选择在第一天的克隆：
- 饲料板块的殖民地，采摘前1-2小时。
- 加入15μl的PBS的一个V型底的96孔盘的水井。
- 含有殖民地，一旦被拾起，用PBS洗净的菜，菜中添加的PBS10毫升。
- 挑选小5μL吸管的技巧（4μLP20 pipetman）殖民地。转让合作在96盘lonies良好。
- 加入20μL胰蛋白酶每口井使用的多通道（12）pipetor。吸取最多下降了3倍。 37 ° 4分钟。
- 100μL的ES培养基中添加胰酶消化菌落。吸取最多下降了10倍。从96菜6克隆一次传输24孔盘，使用在其他位置上每12个地方pipetor的提示。
- 24孔板中的细胞，待细胞达到80％-90％汇合，每日喂养与胚胎干细胞的培养基中生长在37℃，5％CO2培养箱。细胞可能会准备扩大在3-7天。
第4步
- 扩大iPS细胞
- 吸介质，并用1毫升的PBS细胞。
- PBS完全删除，添加0.1毫升的0.25％胰蛋白酶/ 1 mM的EDTA，并培育在37 ° C为10分钟。
- 加入0.4毫升的ES介质，并暂停移液和单细胞悬液细胞。
- 将细胞悬液转移到6孔板以及，加入1.5毫升的ES细胞培养基，孵育在37℃，5％CO2培养箱，直到细胞在6孔板达到80-90％汇合。在这一点上，准备冻结股票的细胞，如下所示。
- 冻结股票的制备
- 吸介质，并用2毫升的PBS细胞。
- PBS完全删除，添加0.5毫升0.25％胰蛋白酶/ 1 mM的EDTA，并培育在37 ° C为10分钟。
- 加入2毫升的ES介质，并暂停移液和单细胞悬液细胞。
- 细胞悬液转移至15毫升管，计数的细胞数和自旋向下的细胞。
- 弃上清，重悬在每毫升含2 × 10 6细胞与ES培养基中的细胞浓度。
- 准备2 ES细胞冻存液（20％二甲基亚砜在ES培养基）和0.5％毫升小瓶分装。
- 0.5毫升细胞悬液转移冻结小瓶，轻轻混匀。
- 在细胞冷冻集装箱的小瓶和保持它在-80 ° C过夜;转移到液氮长期存储的第二天。
Discussion
在这段视频中，我们演示了如何使用诱导，慢病毒系统产生GFP阳性，多能干IPS从MEFs Oct4-GFP/R26-M2rtTA和Nanog-GFP/R26-M2rtTA小鼠的细胞。此过程是一个有用的方法产生的iPS细胞，因为它允许在重组过程中的转基因表达的控制。虽然使用iPS细胞的生成病毒，阻碍了这些细胞在临床上使用，此过程确实让我们回答一些问题，强调尚未定义的重编程过程的主要生物。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Reagent | Sigma-Aldrich | D9891-100G |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Maherali, N., et al. Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
