Summary
וידאו זה מדגים כיצד להשתמש C. elegans להעריך ניוון מוחיים נוירון דופאמין כמודל למחלת פרקינסון. יתר על כן, מסכי גנטית משמשות כדי לזהות גורמים או לשפר ניוון או neuroprotective.
Abstract
שיפורים באבחון וטיפול של מחלת הפרקינסון (PD) תלויים הידע על הגורמים ההופכים רגישות אוכלוסיות בסיכון. בתהליך של ניסיון לזהות גורמים גנטיים הרומן הקשורים פ"ד, מדענים יצרו רשימות רבות של גנים מועמדים, פולימורפיזמים, וחלבונים המייצגים התקדמות חשובה, אך אלה נותרו מוביל מוגדר באופן מכניסטי. העבודה שלנו מכוונת כלפי משמעותית לצמצום רשימות כאלה על ידי ניצול היתרונות של מערכת חיים פשוטה מודל. בעוד בני האדם מיליארדי נוירונים, מיקרוסקופיים התולעת העגולה Caenorhabditis elegans יש בדיוק 302, מתוכן רק שמונה לייצר דופמין (DA) ב hemaphrodites. הביטוי של הגן המקודד את החלבון האנושי פ"ד הקשורים, אלפא synuclein, ב C. elegans תוצאות DA נוירונים במינון וגיל תלויי ניוון מוחיים.
תולעים מביע האדם אלפא synuclein בנוירונים התובע הם isogenic ולהביע הן GFP האדם אלפא synuclein תחת האמרגן טרנספורטר התובע (Pdat-1). הנוכחות של ה-GFP המשמש כסמן דמיינו בקלות עבור הבאים ניוון מוחיים התובע בבעלי חיים אלה. אנחנו בתחילה הראו כי אלפא synuclein-Induced ניוון מוחיים התובע ניתן היה להציל בעלי חיים אלה על ידי torsinA, חלבון עם פעילות המלווה מולקולרית 1. יתר על כן, מועמד פ"ד גנים הקשורים לזהות במעבדה שלנו דרך בקנה מידה גדול המאמצים RNAi ההקרנה באמצעות assay אלפא synuclein misfolding היו אז ביטוי יתר של C. elegans התובע נוירונים. אנו נקבע כי חמישה מתוך שבעה גנים שנבדקו מיוצג מאפננים מועמד משמעותי פ"ד כפי שהם הצילו אלפא synuclein-Induced התובע ניוון מוחיים 2. בנוסף, מעבדת לינדקוויסט (בעיה זו של יופיטר) ביצע מסכי שמרים לפיו אלפא synuclein תלויי רעילות משמש readout עבור גנים יכולה לחזק או להחליש cytotoxicity. לאחר מכן אנו נבחן המועמד גנים שמרים assay C. שלנו אלפא synuclein-Induced ניוון מוחיים elegans ומאומתים בהצלחה רבים של מטרות אלה 3, 4.
המתודולוגיה שלנו כרוך דור של וקטור C. elegans נוירון ספציפי ביטוי התובע באמצעות שיבוט recombinational של cDNAs גן מועמד תחת שליטה של האמרגן Pdat 1. פלסמידים אלה microinjected אז wild-type (N2) תולעים, יחד עם סמן לבחירה לשינוי מוצלח. מספר קווי ייצור מהונדס יציב את החלבון המועמד בנוירונים התובע מתקבלים וחצה אז באופן עצמאי תוך מאמץ אלפא synuclein ניווניות ולהעריך עבור ניוון מוחיים, על בעלי חיים והן ברמה נוירון יחיד, במהלך ההזדקנות.
Protocol
א בנייה הביטוי פלסמיד
שני פלסמידים נדרשים: אחד עבור הביטוי רקמות ספציפיות של הגן ריבית שנייה כסמן שינוי לבחירה (אם כי את הסמן פלסמיד הוא בדרך כלל זמין גם מתוך הקהילה מחקר).
ניסיוני פלסמיד
- בחר האמרגן אשר באה לידי ביטוי סוג רקמה / תא של עניין, במקרה זה, טרנספורטר התובע (Pdat-1) מקדם משמש. זה ביטוי פלסמיד נוצר Gateway Invitrogen מערכת תואמת וקטור היעד (pDEST-DAT-1) כדי לאפשר את הכניסה של הגן כל הזרם עניין של האמרגן על ידי שיבוט recombinational 1.
- CDNA של הגן של הריבית PCR מוגבר באמצעות פריימרים המכילים את עו"ד Gateway רצף B recombinational. CDNA הגברה הוא recombined הראשון לתוך וקטור התורם pDONR201 כדי ליצור את וקטור הערך ולאחר מכן הפך E. coli זן DH5α. להלן מבחר של recombinants מוצלח ומיני הכנה הבידוד של ה-DNA, וקטור הכניסה recombined לתוך וקטור pDEST DAT-1-היעד כדי ליצור את הביטוי פלסמיד. פרטים על שיבוט recombinational זמינים ידנית או Gateway Invitrogen או קולדוול et al. 5.
דה מרקר לבחירה פלסמיד
סמן פלסמיד מהונדס מכיל וקטור עם מקדם נהיגה הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ברקמות ברור. בהליך זה בפרט, האמרגן UNC-54 כוננים ביטוי חלבון דובדבן בשריר הגוף קיר (Punc-54:: דובדבן).
ב דור טראנסגנטי C. elegans דרך Microinjection
ראה מאמר יופיטר בנושא: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833
ג גנטית חוצה לניתוח ניוון מוחיים DA
- תולעים גדלים באמצעות נהלים תקן 6.
- מקום 10 Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: גברים GFP 1, 2 לצלחת זיווג עם 3-4 L4 הרמפרודיטים הבמה מהונדס (להביע Pdat-1: גן X ו Punc-54:: דובדבן) . זה צריך להתבצע בנפרד עבור כל אחד משלושת קווי יציב נפרד נוצר. לאחר יומיים, להסיר את הזכרים.
- בדוק את דור F1, אם יש כמה צאצאים זכרים, הזדווגות היה מוצלח.
- Clone מתוך 5 אנדרוגינוס L4 חיות מן הצלב כל התערוכה הן Pdat-1:: ה-GFP פלורסנט סמן (בירושה מהאב זכר) לבין Punc-54: קיר דובדבן ניאון הגוף שרירים סמן (בירושה מהאב אנדרוגינוס). בעלי חיים משובטים צריכים להיות בשלב L4 על מנת להבטיח כי הם לא הזדווגו עם חיות עדיין זכר הנוכחי על הצלחת. לאפשר להם לחצות עצמית לייצר צאצאים F2.
- חיות F2 מיוצר בשלב 3 הם משובטים החוצה. באופן ספציפי, העברת ~ חיות 5-10 כי התערוכה הן סמנים ניאון צלחות הפרט שלהם. מסך דור F3 עבור צלחות שבו 100% של חיות להביע GFP ב DA נוירונים מסוימים של בעלי חיים הם מביעים דובדבן בגוף תאים קיר השרירים. בעלי חיים אלה יהיו הומוזיגוטים Pdat-1:: α-syn; Pdat-1: גן ה-GFP ביציבות תוך העברת transgene החדש שנוצר (גן X).
ד דופאמין Neuron ניתוח
- הכינו צלחת טרי עבור כל אחד שלוש שורות שנוצרו לעיל, כמו גם את Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: ה-GFP לבד זן. לאפשר להם לגדול לבגרות.
- העברת מהונדס מבוגרים 30-40 מהקו בכל לצלחת חדשה. אפשר להניח אותם עוברים במשך 4 שעות ב 20 º C.
- הסר את המבוגרים. אפשר העוברים להתפתח במשך ימים 3-4 ב-C º 20 עד שהם מגיעים לשלב L4.
- פיק ~ 100 מהונדס L4 חיות לצלחת המכילה 0.04 מ"ג / מ"ל 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR). התפתחות זו חוסמת נוקלאוטיד אנלוגי של הדור הבא באמצעות עיכוב של סינתזה של DNA, ובכך למנוע את הצאצאים מן מכריע את חיות הניסוי 7. הגנו על צלחות FUDR מהאור שכן הוא רגיש לאור.
- בעלי חיים למבוגרים ינותחו על ימים שונים בעקבות הנחת ביצה. הימים המתאימים לניתוח נקבעים אמפירית. לדוגמה, נקבע כי יש לנו 77%, 87% ו 90% Pdat-1:: α-syn; Pdat-1: בעלי חיים GFP התערוכה הידרדר נוירונים התובע ב 6 ימים, 7 ו - 10 פיתוח פוסט, בהתאמה. לכן, אם אנו צופים כי transgene עניין עשוי לשפר ניוון מוחיים, ננתח ביום 6 ו / או 7. כמו כן, transgenes שעשוי לדכא ניוון מוחיים ינותחו על 7 ימים ו -10.
- בצע 4 כריות agarose טרי (בניגוד רפידות אגר microinjection, אלה משמשים טריים אסור לייבש). הגדר את שתי שקופיות מיקרוסקופ כי יש נייר דבק על פני אותם; הקלטת משמשת spacer עבור רפידות עבות שקול. Lay 1 / 3להחליק ביניהם על הספסל (הם ממוקמים שלושה מעודכן). מניחים ירידה של agarose מותכת בשקופית מרכז במהירות שכבה אחר להחליק על גבי agarose, בניצב ועל פני כל שלוש שקופיות. הפוך את כריות נוספות, עוזב את שתי שקופיות יחד עד כרית מוכן לשימוש.
- כדי לנתח תולעת נוירונים התובע, במקום ירידה של 6 μl levamisole 3 מ"מ (הרדמה) על זכוכית 22 x 30 מ"מ מכסה. פיק 40 בוגרים בעלי חיים (10 תוספת מעבר 30 להיות הבקיע) לתוך הטיפה, ואז להפוך זכוכית המכסה על כרית agarose. חזור עבור כל השורות האחרות.
- ציון 30 חיות בכל שורה נוכחות של כל CEP ו ADE נוירון באמצעות מיקרוסקופ מתחם עם epifluorescence ו קובייה מסנן המאפשר ויזואליזציה של FITC או GFP. אנו משתמשים מעניקים GFP HYQ לסנן קוביה (טכנולוגיה Chroma). הקלטת נתונים בגיליון הניקוד המצורפת. Wild-type חיות ישמרו הקרינה GFP להשלים בכל 4 CEP ו 2 נוירונים ADE. בעלי חיים הפרט מציג הפסד של נוירונים התובע הם הבקיע כלא WT או "מתנוונת". כמו כן, במידה של ניוון ניתן הבקיע על ידי ספירת נוירונים שאבדו סך כל חיה, כמו גם האוכלוסייה.
- חזור על ניתוח 2 פעמים נוספות (30 חיות יותר בכל שורה לכל משפט). המספר הכולל של תולעים מציג wild-type נוירונים התובע מתוך שלושה סיבובים של מנתח הוא בממוצע. ניתוח סטטיסטי עבור neuroprotection מבוצע לאחר מכן באמצעות התלמיד מבחן t (p <0.05) להשוות תולעים שליטה (Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP) עם זנים כי יתר להביע מועמד גנים נוירונים DA .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההפסד תלויי גיל של נוירונים דופאמין הוא סימן ההיכר קלינית של מחלת פרקינסון קשור הצטברות או misfolding של חלבון הקרוי אלפא synuclein. כאן אנו מדגימים כיצד התווית, דרך transgene ניאון, נוירונים של דופאמין ג elegans ו לחקות את ניוון מוחיים לראות את מחלת הפרקינסון על ידי coexpressing אדם אלפא synuclein בתאים אלה.
וידאו זה מתאר את המתודולוגיה של חציית צמיחה, גנטית, הרכבה, ועל הניקוד של נמטודות מהונדס להעריך גורמים גנטיים או לשפר ניוון מוחיים או לספק neuroprotection במהלך ההזדקנות. הטיפול נלקח להשתמש סמנים עבור תחזוקה transgene כראוי מבוים זכר הרמפרודיטים כדי להבטיח חוצה גנטית מוצלחת, ועקביות הבקיע אובדן הנוירונים או הגנה. באופן זה, C. elegans מאפשר הערכה מהירה של גורמים גנטיים שעשויים גם לתרום ניוון מוחיים או לייצג מטרות טיפוליות להישרדות נוירון שיפור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. הפרעות תנועה מחקר במעבדה כבר נתמך על ידי דיסטוניה בכמן-Strauss & פרקינסון קרן, קרן הברית פרקינסון, מחלת פרקינסון האגודה האמריקאית, מחלת פרקינסון איגוד אלבמה, ג'יי מייקל פוקס, קרן למחקר פרקינסון מחקר לתואר ראשון
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3x1" | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon Instruments | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology Corp. |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
- Brenner, S.
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
