Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Summary

Este video muestra cómo utilizar C. elegans para evaluar la neurodegeneración nerviosas dopaminérgicas como un modelo para la enfermedad de Parkinson. Además, las pantallas de genética se utilizan para definir los factores que mejoran la degeneración o neuroprotectoras.

Abstract

Mejoras en el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP) dependen de los conocimientos sobre factores de vulnerabilidad que hacen que las poblaciones en riesgo. En el proceso de tratar de identificar nuevos factores genéticos asociados con la enfermedad, los científicos han generado muchas listas de genes candidatos, los polimorfismos y proteínas que representan importantes avances, pero estos conductores siguen mecánicamente indefinido. Nuestro trabajo está dirigido a reducir significativamente estas listas mediante la explotación de las ventajas de un sistema modelo animal simple. Mientras que los humanos tienen miles de millones de neuronas, la lombriz Caenorhabditis elegans microscópica tiene precisamente 302, de los cuales sólo ocho producir dopamina (DA) en hemaphrodites. Expresión de un gen humano que codifica la proteína asociada a la EP, la alfa-sinucleína, en C. elegans resultados neuronas DA de la dosis y la neurodegeneración dependiente de la edad.

Gusanos expresar humana alfa-sinucleína en las neuronas DA son isogénicas y expresar tanto las buenas prácticas agrarias y los derechos humanos alfa-sinucleína en el promotor del transportador de DA (Pdat-1). La presencia de GFP sirve como un marcador visualiza fácilmente para el seguimiento de la neurodegeneración DA en estos animales. Inicialmente se demostró que la alfa-sinucleína la neurodegeneración inducida por DA podrían ser rescatados en estos animales por torsinA, una proteína con actividad chaperona molecular ^1. Además, el candidato PD relacionadas con los genes identificados en nuestro laboratorio a través de grandes esfuerzos de detección RNAi mediante una prueba de mal plegamiento de la alfa-sinucleína eran entonces sobre-expresado en C. elegans neuronas DA. Se determinó que cinco de los siete genes probados representado moduladores candidato importante de la EP, ya que rescató a la alfa-sinucleína inducida por la neurodegeneración DA ^2. Además, el laboratorio de Lindquist (este número de Jove) ha llevado a cabo las pantallas de la levadura por el que la alfa-sinucleína toxicidad dependiente se utiliza como una lectura de los genes que pueden aumentar o suprimir la citotoxicidad. Nos examinó a continuación los genes candidatos de la levadura en nuestro ensayo de C. elegans neurodegeneración alfa-sinucleína y la inducida por validado con éxito muchos de estos ^{tres objetivos, 4.}

Nuestra metodología se basa en la generación de un vector de expresión de C. elegans DA neuronal específica con la clonación de cDNAs de recombinación de genes candidatos bajo el control del Pdat-1 promotor. Estos plásmidos son entonces microinyección de tipo salvaje (N2) gusanos, junto con un marcador de selección para la transformación exitosa. Múltiples líneas transgénicas estables de producir la proteína en las neuronas DA candidato se obtienen y se cruzó de manera independiente en la cepa de la alfa-sinucleína degenerativas y evaluados por la neurodegeneración, en el animal y el nivel de las neuronas individuales, en el curso del envejecimiento.

Protocol

A. Construcción de plásmido de expresión

Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables (aunque el marcador plásmido está generalmente disponible dentro de la comunidad de investigación).

Experimental plásmido

1. Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, en este caso, el transportador de DA (Pdat-1) se utiliza el promotor. Este plásmido de expresión fue creada como una puerta de enlace Invitrogen sistema compatible con vector destino (pDEST-DAT-1) para permitir la inserción de un gen de interés aguas abajo del promotor de la clonación de recombinación ^1.
2. El cDNA del gen de interés es amplificado por PCR utilizando los cebadores que contienen la puerta de enlace att secuencia B de recombinación. El cDNA amplificado por primera vez se recombinan en el vector de donantes pDONR201 para crear el vector de entrada y luego se transformó en la cepa E. coli DH5a. Después de la selección de recombinantes éxito y mini-prep aislamiento de ADN, el vector de entrada es recombinada en el pDEST-DAT-1 vector de destino para crear el plásmido de expresión. Detalles sobre la clonación de recombinación están disponibles, ya sea el manual de Invitrogen Gateway o en Caldwell et al. ^5.

Marcador seleccionable plásmido

Un marcador plásmido transgénico consiste en un vector con un promotor que determinan la expresión de una proteína fluorescente en un tejido obvio. En este procedimiento en particular, el promotor unc-54 unidades de expresión de la proteína de cerezo en el cuerpo de la pared muscular (punción-54:: cereza).

B. Generación de transgénicos a través de C. elegans microinyección

Ver artículo relacionado Jove: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. cruza genética para el análisis de la neurodegeneración DA

1. Los gusanos son cultivados usando procedimientos estándar de ^6.
2. Lugar 10 Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP los hombres ^{1, 2} sobre una placa de acoplamiento con 4.3 L4 etapa hermafroditas transgénicos (que expresa Pdat-1:: gen X y punción de 54:: cherry) . Esto debe realizarse de forma individual para cada una de las tres líneas separadas estable creado. Después de dos días, eliminar a los machos.
3. Inspeccione la generación F1, si hay varios hijos varones, el apareamiento tuvo éxito.
4. Clon de 5 hermafrodita L4 animales de cada cruz que exhiben tanto el Pdat-1:: GFP fluorescentes marcador (heredado de los padres varones) y el 54 punción:: cherry pared fluorescentes cuerpo marcador de músculo (se hereda de los padres hermafrodita). Que los animales clonados tienen que estar en la etapa de L4 para asegurarse de que aún no han apareado con machos presentes en la placa. Les permitan auto-cross y producir una progenie F2.
5. F2 animales producidos en el paso 3 se clonan a cabo. En concreto, la transferencia de los animales ~ 5.10 que exhiben ambos marcadores fluorescentes para sus platos individuales. Pantalla de la generación F3 para las placas donde el 100% de la GFP animales expresan en las neuronas DA y algunos de los animales se expresa la cereza en las células del cuerpo músculo de la pared. Estos animales serán homocigotos para el Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: gen GFP, mientras que de forma estable la transmisión de la recién creada transgén (gen X).

D. Análisis de las neuronas dopaminérgicas

1. Prepare un plato fresco para cada una de las tres líneas creadas anteriormente, así como la Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP sola cepa. Les permiten crecer a la edad adulta.
2. La transferencia de los adultos 30-40 transgénicos de cada línea en un plato fresco. Les permitan sentar los embriones de 4 horas a 20 º C.
3. Retire los adultos. Permita que los embriones para desarrollar durante 3-4 días a 20 º C hasta que alcancen la etapa de L4.
4. Elige ~ 100 L4 transgénicos animales a una placa que contiene 0,04 mg / ml 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR). Este desarrollo nucleótidos bloques analógicos de la próxima generación a través de la inhibición de la síntesis de ADN, evitando así la descendencia de los animales de experimentación abrumadora ^7. Proteger las placas FUDR de la luz, ya que es sensible a la luz.
5. Los animales adultos se analizaron en varios días después de la puesta de huevos. El día de análisis apropiados se determinan empíricamente. Por ejemplo, hemos determinado que el 77%, 87% y 90% de los Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP animales exhiben degenerado neuronas DA en los días 6, 7 y 10 de desarrollo posterior, respectivamente. Por lo tanto, si podemos predecir que el transgen de interés podría aumentar la neurodegeneración, vamos a analizar en el día 6 y / o 7. Del mismo modo, los transgenes que podrían suprimir la neurodegeneración se analizarán en los días 7 y 10.
6. Hacer 4 pastillas de dulce de agarosa (a diferencia de las pastillas de microinyección agar, estos se utilizan frescos y no permitir que se seque). Se establecen dos portaobjetos de microscopio que tienen un pedazo de cinta a través de ellas, la cinta sirve como separador de pastillas de equivalente de espesor. Ponga un terciodeslice entre ellos en el banco (que se colocan de tres al día). Coloque una gota de agarosa fundida en el centro de la diapositiva y rápidamente poner otra diapositiva en la parte superior de la agarosa, perpendicular y en las tres diapositivas. Hacer varias almohadillas adicionales, dejando a los dos portaobjetos, hasta que la pastilla se encuentra listo para su uso.
7. Para el análisis de gusano neuronas DA, el lugar una caída de 6 l de levamisol mm 3 (un anestésico) en un 22 x 30 mm cubierta de vidrio. Recoger 40 animales adultos (10 extra más allá de los 30 que anotó) dentro de la gota, y luego invertir la cubierta de cristal en la almohadilla de agarosa. Repita este procedimiento para cada una de las otras líneas.
8. Puntuación 30 animales por cada línea de la presencia de cada CEP y la neurona ADE utilizando un microscopio compuesto con epifluorescencia y un cubo de filtro que permite la visualización del FITC o GFP. Nosotros usamos un filtro de ganar a las buenas prácticas agrarias HyQ cubo (Chroma Technology). Anota los datos en la hoja de registro adjunta. Animales de tipo salvaje mantendrá fluorescencia de GFP completa en todos los CEP 4 y 2 neuronas ADE. Animales individuales mostrando la pérdida de neuronas DA se califican como no-WT o "degeneración". Del mismo modo, el grado de degeneración se puede marcar, contando el total de las neuronas perdidas en cada animal, así como a la población.
9. Repetir el análisis dos veces más (30 animales más por línea de prueba). El número total de gusanos de tipo salvaje exhibiendo las neuronas DA de las tres rondas de análisis es el promedio. El análisis estadístico para la neuroprotección continuación, se realiza utilizando la t de Student-test (p <0,05) para comparar los gusanos de control (Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP) con las cepas que sobreexpresan genes en las neuronas DA .

Discussion

La pérdida depende de la edad de las neuronas de dopamina es una característica clínica de la enfermedad de Parkinson y se ha asociado con la acumulación o el mal plegamiento de una proteína llamada alfa-sinucleína. Aquí se demuestra la forma de etiqueta, a través de un transgén fluorescentes, las neuronas dopaminérgicas de la C. elegans e imitar la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson por coexpressing humana alfa-sinucleína en estas células.

Este video muestra la metodología para el crecimiento, cruce genético, el montaje, y la puntuación de los nematodos transgénicos para evaluar los factores genéticos que, o bien mejorar la neurodegeneración o proporcionar neuroprotección en el curso del envejecimiento. Hay que tener cuidado de usar marcadores para el mantenimiento de los transgenes adecuadamente organizado masculinos y hermafroditas para asegurar el éxito de los cruces genéticos, y la coherencia en la puntuación de la pérdida de neuronas o de protección. De esta manera, C. elegans facilita una rápida evaluación de los factores genéticos y que puede contribuir a la neurodegeneración o representar dianas terapéuticas para mejorar la supervivencia de las neuronas.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Microscope Slides	Plain, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Dissecting with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645
Epifluorescent	Microscope	Nikon Instruments	Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.