Summary
هذا الفيديو يوضح كيفية استخدام جيم ايليجانس لتقييم الدوبامين العصبية تنكس عصبي كنموذج لمرض باركنسون. وعلاوة على ذلك ، تستخدم شاشات الجينية لتحديد العوامل التي تعزز إما انحطاط أو اعصاب.
Abstract
تحسينات في تشخيص وعلاج مرض الشلل الرعاش (PD) تتوقف على معرفة العوامل التي تجعل قابلية السكان المعرضين للخطر. في عملية محاولة تحديد العوامل الوراثية المرتبطة PD الرواية ، وقد ولدت كثير من علماء الجينات قوائم المرشحين ، تعدد الأشكال ، والبروتينات التي تمثل تقدما هاما ، ولكن هذه لا تزال غير معروف يؤدي ميكانيكيا. ويهدف عملنا في اتجاه تضييق هذه القوائم بشكل كبير من خلال استغلال مزايا نظام الحيوان نموذج بسيط. في حين أن البشر لديهم المليارات من الخلايا العصبية ، والمجهرية الدودة ايليجانس انواع معينة و302 على وجه التحديد ، والتي تنتج سوى ثمانية الدوبامين (DA) في hemaphrodites. التعبير عن الجينات البشرية ترميز البروتين PD - المرتبطة بها ، synuclein ألفا ، في نتائج ايليجانس جيم الخلايا العصبية DA في الجرعات والتي تعتمد على سن تنكس عصبي.
معربا عن الديدان البشرية ألفا synuclein في الخلايا العصبية هي DA إسوي والتعبير وحقوق الإنسان على حد سواء GFP ألفا synuclein تحت المروج نقل DA (Pdat - 1). وجود GFP بمثابة علامة تصور بسهولة ليلي DA تنكس عصبي في هذه الحيوانات. أثبتنا في البداية أنه يمكن انقاذ ألفا synuclein التي يسببها DA تنكس عصبي في هذه الحيوانات التي torsinA ، وهو بروتين مع النشاط كوصي الجزيئية 1. مزيد من مرشح PD - الجينات ذات الصلة التي تم تحديدها في المختبر على نطاق واسع عبر جهود الفحص رني باستخدام مقايسة misfolding ألفا synuclein ثم تم الإفراط في المعبر عنها في DA جيم ايليجانس الخلايا العصبية. توصلنا إلى أن خمسة من بين سبعة اختبار الجينات ممثلة جهري مرشح كبير من المشتريات لأنها أنقذت ألفا synuclein التي يسببها DA تنكس عصبي 2. بالإضافة إلى ذلك ، أجرى مختبر ليندكويست (هذه مسألة إن الرب) شاشات الخميرة حيث يستخدم ألفا synuclein تعتمد سمية بوصفها قراءات للجينات التي يمكن أن تعزز أو قمع السمسة. درسنا في وقت لاحق من الجينات المرشحة لدينا الخميرة في مقايسة ايليجانس جيم تنكس عصبي ألفا synuclein المحرض والتحقق من صحة بنجاح العديد من هذه الأهداف 3 و 4.
منهجيتنا ينطوي على جيل من متجه جيم ايليجانس DA التعبير الخلايا العصبية الخاصة به استنساخ الجين cDNAs تهجيني من مرشح تحت سيطرة المروج Pdat - 1. ثم يتم microinjected هذه الديدان في البلازميدات (N2) من النوع البري ، جنبا إلى جنب مع علامة اختيار للتحول الناجح. ويتم الحصول على خطوط متعددة مستقرة وراثيا تنتج البروتين في الخلايا العصبية DA مرشح وعبروا بشكل مستقل ثم إلى سلالة ألفا synuclein التنكسية والمقررة لتنكس عصبي ، في الحيوان على حد سواء وعلى مستوى الخلايا العصبية الفردية ، على مدى الشيخوخة.
Protocol
ألف البناء التعبير البلازميد
مطلوبة البلازميدات اثنين : واحد للتعبير عن الأنسجة محددة من الجينات في المصالح ، والمرتبة الثانية من حيث اختيار علامة التحول (على الرغم من علامة البلازميد وعادة ما يتوفر من داخل الأوساط البحثية).
التجريبية البلازميد
- حدد المروج التي يعبر عنها في نوع النسيج / خلية من الاهتمام ، وفي هذه الحالة ، نقل DA (Pdat - 1) يستخدم المروج. تم إنشاء هذا التعبير البلازميد باعتبارها بوابة Invitrogen نظام متوافق مع ناقلات الوجهة (pDEST - DAT - 1) للسماح الإدراج في أي من الجين المصب مصلحة المروج عن طريق الاستنساخ تهجيني 1.
- [كدنا] من الجينات ذات الاهتمام هو تضخيم PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على تسلسل عبارة B ATT تهجيني. هو معاد لأول مرة [كدنا] تضخيم في ناقلات pDONR201 المانحة لإنشاء ناقلات دخول ثم تحولت إلى سلالة بكتيريا E. DH5α. بعد اختيار recombinants ناجحة وصغيرة من الحمض النووي الإعدادية العزلة ، هو معاد للناقلات دخول pDEST - DAT - 1 ناقلات المقصد لإنشاء التعبير البلازميد. تفاصيل حول الاستنساخ تهجيني تتوفر إما من دليل أو في عبارة Invitrogen كالدويل وآخرون 5.
اختيار ماركر البلازميد
علامة المعدلة وراثيا البلازميد يتكون من ناقلات مع المروج القيادة والتعبير عن بروتين فلوري في الأنسجة واضحة. في هذا الإجراء بصفة خاصة ، والمروج UNC - 54 محركات الكرز التعبير البروتين في العضلات جدار الجسم (Punc - 54 : الكرز).
باء توليد ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عبر Microinjection
إن الرب انظر المادة ذات الصلة : http://www.jove.com/index/details.stp؟ID=833
جيم الصلبان الوراثية لتحليل تنكس عصبي DA
- تزرع الديدان باستخدام الاجراءات القياسية 6.
- مكان Pdat 10 - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : : ذكور : GFP 1 و 2 على لوحة التزاوج مع 3-4 L4 المرحلة المخنثين المعدلة وراثيا (التعبير عن Pdat - 1 : : الجينات وPunc X - 54 : الكرز) . يجب أن يتم تنفيذ هذا بشكل فردي لكل واحد من ثلاثة خطوط منفصلة مستقرة بإنشائه. بعد يومين ، وإزالة الذكور.
- تفقد الجيل F1 ؛ إذا كانت هناك ذرية من الذكور عدة ، تزاوج ناجحة.
- استنساخ من أصل 5 خنثى L4 الحيوانات من عبور كل الذي يحمل كلا من Pdat - 1 : : GFP الفلورسنت علامة (موروث من الأصل من الذكور) و54 - Punc : الكرز جدار الجسم الفلورسنت علامة العضلات (الموروثة من الأم خنثى). الحيوانات المستنسخة الحاجة إلى أن تكون في مرحلة L4 لضمان أن لا تزاوج الذكور حتى الآن مع الحيوانات الموجودة على اللوحة. تسمح لهم في تقرير المصير ، عبر وإنتاج ذرية F2.
- يتم استنساخ الحيوانات المنتجة F2 في الخطوة 3 من أصل. على وجه التحديد ، ونقل الحيوانات ~ 50-10 الذي يحمل كل من علامات الفلورسنت لوحات الفردية الخاصة بهم. شاشة الجيل F3 لوحات فيها 100 ٪ من الحيوانات في التعبير عن GFP DA الخلايا العصبية وبعض الحيوانات هي تعبير عن الكرز في خلايا الجسم في العضلات الجدار. وسوف تكون هذه الحيوانات متماثلة اللواقح بالنسبة للPdat - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : : GFP الجينات بينما يحيل ستابلي والتحوير التي أنشئت حديثا (الجينات X).
دال تحليل الخلية العصبية الدوبامينية
- إعداد لوحة جديدة لكل من الخطوط الثلاثة تم إنشاؤها أعلاه ، وكذلك Pdat - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : وحده GFP السلالة. يسمح لها أن تنمو إلى مرحلة البلوغ.
- نقل البالغين 30-40 المعدلة وراثيا من كل سطر على لوحة جديدة. السماح لهم لوضع الأجنة لمدة 4 ساعات عند 20 درجة مئوية.
- إزالة البالغين. السماح للأجنة لتطوير لمدة 3-4 أيام عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4.
- اختيار ~ 100 المعدلة وراثيا L4 الحيوانات إلى لوحة تحتوي على 0.04 ملغ / 5 مل ، الفلورية 2' - deoxyuridine (FUDR). هذا النوكليوتيدات التنمية كتل التناظرية من الجيل القادم عن طريق تثبيط تركيب الحمض النووي ، وبالتالي منع النسل الساحقة من الحيوانات التجريبية 7. حماية لوحات FUDR من الضوء لأنها حساسة للضوء.
- وسيتم تحليل الحيوانات الكبار في الأيام التالية مختلف زرع البويضة. ويتم تحديد الأيام الملائمة لتحليل تجريبيا. على سبيل المثال ، فقد عقدنا العزم أن 77 ٪ ، 87 ٪ و 90 ٪ من 1 Pdat : α - SYN ؛ Pdat - 1 : : حيوانات GFP المعرض تحول الخلايا العصبية DA في أيام 6 و 7 و 10 تطور آخر ، على التوالي. لذلك ، إذا نتوقع أن التحوير الاهتمام قد تعزز تنكس عصبي ، وسوف نقوم بتحليل في يوم 6 و / أو 7. وبالمثل ، سيتم تحليل الجينات المحورة التي قد قمع تنكس عصبي في أيام 7 و 10.
- 4 منصات جديدة تجعل agarose (خلافا لمنصات microinjection آغار ، وتستخدم هذه الطازجة وغير مسموح لتجف). المبينة الشرائح المجهر اللتين قطعة من الشريط عبرها ؛ الشريط بمثابة هل لمنصات سميكة مكافئ. وضع 1 / 3الشريحة بينهما على مقاعد البدلاء (متوضعة كانوا ثلاثة على علم). وضع قطرة من agarose المنصهر على الشريحة مركز ووضع بسرعة شريحة أخرى على رأس agarose ، وعبر عمودي على كافة الشرائح الثلاث. جعل منصات إضافية عديدة ، تاركة الشرائح اثنين معا حتى منصة جاهزة للاستخدام.
- لتحليل الخلايا العصبية دودة DA ، مكان هبوط 6 ميكرولتر من Levamisole 3 ملم (مخدر) على 22 × 30 مم زجاج الغطاء. اختيار الحيوانات البالغة 40 (10 اضافية تتجاوز 30 إلى أن سجل) في هذا التراجع ، ثم عكس الزجاج غطاء على وسادة agarose. كرر لكل من الخطوط الاخرى.
- تسجيل 30 حيوانات في كل سطر من وجود كل عصبون ADE CEP وباستخدام مجهر مركب مع epifluorescence مكعب والتصفية التي تسمح برؤية FITC أو GFP. نستخدم منح GFP HYQ فلتر المكعب (تكنولوجيا كروما). بيانات السجل على ورقة التسجيل المرفقة. وسوف الحيوانات البرية من نوع الاحتفاظ الكامل في جميع مضان GFP CEP (4) والخلايا العصبية ADE 2. وسجل الحيوانات الفردية العارضة فقدان الخلايا العصبية كما WT - DA غير أو "التحول". وبالمثل ، يمكن سجل مدى انحطاط عن طريق عد الخلايا العصبية خسر في مجموع كل حيوان وكذلك السكان.
- كرر أكثر من مرة التحليل 2 (30 حيوانات أكثر في كل سطر لكل محاكمة). وبلغ العدد الإجمالي للديدان واظهار البرية من نوع الخلايا العصبية DA من ثلاث جولات من التحليلات. يتم تنفيذ ذلك التحليل الإحصائي لالعصبية باستخدام والطالب اختبار t (ع <0.05) مقارنة الديدان التحكم (Pdat - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : : GFP) مع سلالات أن الجينات مرشح الإفراط في التعبير عنها في الخلايا العصبية DA .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ضياع العمر التي تعتمد على الخلايا العصبية الدوبامين هي السمة المميزة السريري للمرض باركنسون وارتبط مع تراكم أو misfolding من بروتين يسمى ألفا synuclein. نحن هنا لشرح كيفية التسمية ، عن طريق التحوير الفلورسنت ، والخلايا العصبية الدوبامين من C. ايليجانس وتقليد تنكس عصبي ينظر في مرض باركنسون بواسطة الإنسان coexpressing ألفا synuclein في هذه الخلايا.
هذا الفيديو يصور منهجية لعبور ، والنمو الوراثية والمتصاعدة ، وسجل من الديدان الخيطية جينيا لتقييم العوامل الوراثية التي تعزز إما تنكس عصبي أو توفير الحماية العصبية على مدى الشيخوخة. هو الحرص على استخدام علامات لصيانة نظم التحوير مناسب الذكور والمخنثين لضمان نجاح الصلبان الوراثية ، والاتساق في تسجيل خسارة الخلايا العصبية أو الحماية. بهذه الطريقة ، C. ايليجانس يسهل التقييم السريع للعوامل الجينية التي قد تسهم إما إلى تنكس عصبي أو تمثل الأهداف العلاجية للبقاء الخلايا العصبية تعزيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نعترف الروح التعاونية لجميع أفراد مختبر كالدويل. وقد تم دعم حركة البحث اضطرابات في المختبر من خلل التوتر باخمان شتراوس ومؤسسة باركنسون ، مؤسسة باركنسون المتحدة الأمريكية جمعية مرض باركنسون ، جمعية مرض باركنسون ولاية ألاباما ، وجيه مايكل فوكس مؤسسة للأبحاث مرض باركنسون ، والبحوث الجامعية
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3x1" | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon Instruments | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology Corp. |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
