Изучение мембранных биогенеза с люциферазы основе Пробирной Гена Репортер

Summary

Здесь мы описываем процедуры для изучения изменений в фагоцитоз-индуцированной экспрессии гена люциферазы с журналистом гена подход с использованием двойного GloTM люциферазы системы Пробирной от Promega.

Abstract

Для изучения координации различных путей синтеза липидных мембран в течение биогенеза это полезно для работы с экспериментальной системе, где мембранных биогенеза происходит быстро и в индуцибельной образом. Мы обнаружили, что фагоцитоз бисером латекса удобны для этих целей как клетки быстро синтезировать мембранных липидов мембран для пополнения бассейнов потеряли как упаковка материала в процессе частиц охвате. Здесь мы описываем процедуры для изучения изменений в фагоцитоз-индуцированной экспрессии гена люциферазы с журналистом гена подход с использованием двойного Glo люциферазы системы Пробирной от Promega.

Protocol

Культуре клеток

1. Сток культурах человеческих эмбриональных почек 293 (HEK293) клетки выращиваются в 10-см блюда культуры в "средний", состоящий из среднего Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением коктейль из антибиотиков (100 единиц на мл пенициллина и 100 мкг на мл стрептомицина сульфат) и 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ФБС).
2. Для установки камер для эксперимента, среду отсасывают и клетки промывают два раза с 5 мл фосфатного буферного раствора (PBS) решение.
3. PBS затем удаляется и заменяется 0,6 мл раствора, содержащего 0,25% трипсина.
4. Блюдо инкубировали при 37 ˚ С в течение 2 минут, пока клетки начали отделяться.
5. 5,5 мл среды добавляют для нейтрализации трипсина и клетки считаются с гемоцитометра.
6. Клетки разбавляют до 320 000 клеток на мл и разливают по 0,1 мл на лунку в полилизином покрытой 96-луночного планшета для культуры.
7. Место блюдо в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ˚ С и атмосфере, содержащей 8,8% СО2 и расти в течение 24 часов.

Трансфекции

1. При подготовке к трансфекции, его следует рассматривать, сколько воспроизводит должны быть выполнены в экспериментальных условиях и какие объемы плазмиды будет трансфекции. Мы регулярно выполнять все условия, в трех экземплярах и трансфекции в общей сложности от 50 до 100 нг плазмидной ДНК на лунку. Плазмиды смеси должны включать, по крайней мере репортер построить выражения люциферазы светляков и контроль плазмиды выражения Renilla люциферазы из конститутивного промотора.
2. Плазмиды решения пипетируются в 1,5-мл пробирки микроцентрифужных и с добавлением 10 мкл на образец без сыворотки и антибиотиков DMEM. Например, если 20 скважин каждая из которых будет трансфицированных 50 мкг ДНК, добавить 200 мкл DMEM до 1 мкг ДНК.
3. Для DMEM / ДНК раствора добавить 3 мкл транзитного 293 реагента (Mirus) на мкг ДНК. Смешать с помощью пипетки до и вниз и пусть образцы выдерживают при комнатной температуре не менее 10 мин.
4. В течение этого периода, извлеките носитель из 96-луночного планшета для культуры и заменить 90 мкл свежей среды А.
5. Для каждой лунки добавить по 10 мкл DMEM / ДНК / Транзит 293 смеси.
6. Место блюдо в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ˚ С и атмосфере, содержащей 8,8% СО2 и расти в течение 24 часов.

Фагоцитоз

1. Подготовка суспензий, содержащих средний B (смесь 1:1 DMEM и F12 среда Хэма плюс антибиотики и 10% ЭТС), а также 0,75-мкм бисером латекса при нулевой до 1 мг на мл.
2. Удаление информации из 96-луночного планшета для культуры и заменить 0,1 мл суспензии шарик в среде Б.
3. Спиновые пластине в течение 2 мин при 1000 х г.
4. Затем клетки культивировали при 37 ˚ С в течение от 6 до 16 часов. В зависимости от условий и промоутер используется для привода люциферазы, повышенную экспрессию гена-репортера может быть обнаружен после 1 до 3 часов.
5. В тех же случаях может оказаться необходимым для инкубации клеток с бисером от 30 до 60 мин, затем сделать 2 промывок PBS для удаления неинкорпорированных бисера и добавить свежий СМИ до инкубации клеток для дополнительного периода времени.

Двойной GloTM люциферазы Пробирной

1. Обратите внимание: наш протокол для использования этого комплекта отличается в некоторых отношениях от рекомендованного производителем. Он был изменен, чтобы уменьшить количество реагентов на один образец.
2. Приготовьте раствор из 1 М ДТТ, разделить на несколько мелких аликвоты и хранят при температуре -20 ˚ C.
3. Подготовка лизис буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl (рН 7,8), 10% (объем / объем) глицерин и 0,5% (об. / об), Тритон Х-100. Перед использованием аликвоту сумму, необходимую для проведения эксперимента и добавить 1 мкл на мл 1 М ДТТ плюс коктейль ингибиторов протеазы до конечной концентрации от 0,5 до 1x. Не используйте повторно раствор оставшиеся DTT.
4. При использовании двойного комплекта GloTM в первый раз, готовить (Firefly) люциферазы реагентов, передав все содержимое одной бутылки двойного GloTM люциферазы Buffer (входит в комплект) к одной бутылки двойного GloTM люциферазы субстрата (при условии, в комплект). Разделите неиспользованные люциферазы реагента в 10-мл аликвоты и хранят при температуре -20 ˚ C.
5. Удалить 96-луночного планшета от культуры тканей инкубатора и поместить его на льду. Удалить СМИ стремлением, добавить 40 мкл на лунку лизирующего буфера, а затем оставить пластину на льду в течение 30 мин.
6. В белой, непрозрачной 96-луночного планшета (OptiplateTM-96, Перкин Элмер каталожный номер 6005290) Аликвоту 15 мкл на лунку люциферазы реагента, а затем добавить 15 мкл клеточного лизата.
7. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем прочитать люминесценции в микропланшетного.
8. Непосредственно перед использованием, подготовить соответствующее количество Renilla люциферазы раствора субстрата, добавив 1 часть двойного GloTM Стоп & Glo ®; Реагент (входит в комплект) до 100 частей двойного GloTM Стоп & Glo ® буфера (входит в комплект).
9. Для каждой лунки добавляют 15 мкл на лунку Renilla люциферазы раствора субстрата, инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем измеряют люминесценции снова.