Summary
Nous décrivons ici la technique de la préparation et l'entretien des chambres compartimentées pour les neurones sensoriels en culture des ganglions de la racine dorsale.
Abstract
Neurones étendre les processus axonal qui sont loin du corps cellulaire pour innerver les tissus cibles, où la cible des facteurs de croissance dérivés sont nécessaires pour la survie des neurones et la fonction. Les neurotrophines sont spécifiquement requis pour maintenir la survie et la différenciation des neurones sensoriels innervant mais la question de savoir comment ces neurotrophines cibles dérivées de communiquer vers le corps cellulaire des neurones innervant a été un domaine de recherche actif depuis plus de 30 ans. Le modèle le plus communément acceptée de la façon dont les signaux atteignent neurotrophine du corps cellulaire propose que la signalisation endosomes réaliser ce signal rétrograde le long de l'axone. Afin d'étudier le transport rétrograde, un système de culture a été initialement conçu par Robert Campenot, dans laquelle les corps cellulaires sont isolés de leurs axones. La technique de préparation de ces chambres compartimentées pour les récapitule en culture des neurones sensoriels de la stimulation sélective des terminaisons neuronales qui se produit dans le communiqué suivant in vivo de cibles dérivées de neurotrophines. Rétrograde événements de signalisation qui exigent longue portée transport rétrograde microtubules dépendants ont des implications importantes pour le traitement des troubles neurodégénératifs.
Protocol
Préparation des réactifs
- Revêtement collagène: le collagène manteau de p35 plaques de culture tissulaire et les placer dans une étuve à 37 ° C pendant 2 jours avant le graissage des diviseurs. La concentration finale de collagène devrait être à 0,71 mg / ml dilué dans 0,001 N HCl. Puis, ajoutez 1 ml de mélange par plaque.
- Chargeurs de graisse: Afin de combler le chargeur de graisse, une seringue de 60 ml doit d'abord être rempli de graisse à vide Corning. Utiliser la seringue pour remplir le chargeur de la graisse, l'envelopper dans du papier et ensuite l'autoclave pendant 45 minutes.
- Diviseurs Téflon: les diviseurs peuvent être réutilisés après chaque expérience, mais doit d'abord être bien nettoyés. Retirez le diviseur de la plaque, essuyez toutes les graisses restantes et les placer dans l'acide sulfurique pendant 2 jours. Après avoir retiré de l'acide, rincer à l'eau 3X, faire bouillir pendant 20 minutes, laisser sécher, placer dans un plat en verre P100 de Pétri et l'autoclave pendant 20 minutes.
- N2-méthylcellulose: Peser 1,5 g de méthylcellulose et le placer dans une bouteille de 500 ml. Ajouter un barreau et il autoclave pendant 20 minutes à sec (à partir de ce point de tous les travaux doivent être stériles). Ensuite, ajoutez 500 ml de sérum médias libres (N 2), et mélanger dans une chambre froide jusqu'à ce qu'elle se dissolve. Aliquoter en 50 ml Coniques et congeler à -20 ° C. Pour le stock, partie aliquote de travail l'un des 50 Coniques mL dans des tubes de 1 ml et congeler à -20 ° C.
- DRG médias: DMEM, 5% de sérum de cheval inactivé par la chaleur, la streptomycine et 1% de pénicilline.
- 100ng/mL DRGN médias: La concentration des stocks de ces deux facteurs de croissance nerveuse (NGF) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) est 1mg/mL. Diluer chacun des neurotrophines 1:10.000 dans les médias DRG. Les cultures peuvent être cultivées dans NGF seul; cela modifie le complément de neurones qui survivent dans les cultures.
Remarque: Si nécessaire, la concentration de (cytosine arabinoside) Arac est 1um et utilisé à une concentration finale de 0.3uM. Ce sera d'inhiber la croissance des cellules de Schwann et des cellules gliales d'autres. - 10ng/mL DRGN médias: Diluer le 100ng/mL DRGN médias (01h10) avec les médias DRG.
Outils Figure 1. Nécessaire pour mettre en place
Mise en place des chambres compartimentées (démarrer ce processus 1-2 jours avant la dissection)
- Faire une égratignure au milieu d'un revêtues de collagène p35 plat avec un mouvement vers l'extérieur.
- 30ul Lieu de N2-méthylcellulose sur le milieu de la rayure. Set plats de côté jusqu'à ce diviseur est graissé.
- Fixez un adaptateur de calibre 23 talon de Luer pour le chargeur de graisse. Saisir le diviseur de Teflon avec une paire de pinces hémostatiques 90 ° d'angle et le poser à plat avec le diviseur vers le haut sous un microscope. Trace le diviseur avec de la graisse en s'assurant que chaque fois que l'adaptateur est placé à un nouveau point de départ de l'adaptateur est inséré dans la graisse de l'étape précédente afin qu'il y ait une ligne continue de la graisse (voir schéma). Une fois que la graisse est appliquée à l'ensemble du diviseur, tournez l'un des plats préparés p35 à l'envers et la placer de sorte que le N2-méthylcellulose est sur le compartiment du milieu. Appuyez sur le fond du plat avec une paire de pincettes. Veillez à appuyer sur l'intérieur de la cloison dans les quatre coins (en haut à gauche, en bas à droite, en haut à droite, en bas à gauche, indiqué dans le schéma par «X»).
Figure 2: Étapes pour graisser le diviseur
Remarque: Il est important d'appuyer assez fermement pour que la graisse fait une étanchéité totale avec le plat, mais si trop de pression est ajoutée, les axones ne franchira pas dans les compartiments latéraux.
Ramassez les pinces hémostatiques, retournez-le et débrider le diviseur. Enfin, placez le plat avec le diviseur fermement attaché sous le microscope se concentrant sur le fond du compartiment du milieu. Avec le chargeur de la graisse, faire une petite barrière (0,25 cm) de sorte qu'une fois que les cellules sont placées dans le compartiment central, ils ne peuvent pas s'échapper. - Après avoir mis en place plusieurs cultures, les médias DRG place dans chacun des compartiments latéraux et les placer dans un incubateur dans lequel les cellules seront maintenues. Autoriser les cultures de s'asseoir pendant plusieurs heures et ensuite vérifier les fuites. Si les médias ont fui dans le compartiment du milieu, puis la culture est inutilisable.
Remarque: Lors de la première formation à cette technique, il est important de mettre en place des cultures plus que nécessaire pour une expérience, que plusieurs seront étanches.
Figure 3: "Bonne vs fuient la« culture
Le maintien des neurones DRG dans les cultures compartimentées
- Jour 1: Remplacer DRG des médias dans les compartiments latéraux avec 100ng/mL DRGN médias + AraC. Effectuer la dissection et ajouter des cellules à compartiment central (100 000 cellules).
- Jour 2: Ajouter 10ng/mL médias + AraC à l'extérieur du diviseur de téflon jusqu'à ce que le flux média au cours de la barrière de la graisse fluide et les échanges avec le compartiment central.
- Jour 3: Remplacer les médias dans les compartiments latéraux pour 100ng/mL DRGN omettant l'ARAC et l'entourer de 10ng/mL DRGN omettant l'ARAC.
- Jour 6: Remplacer les médias dans les compartiments latéraux pour 1ng/ml + AraC et les entourer avec les médias DRG + AraC.
- Jour 9: Utilisation de l'expérimentation.
Figure 4: les images IHC des corps cellulaires et les axones distaux
Remarque: Lorsque vous changez les médias, il est important d'aspirer le liquide de la partie supérieure du compartiment côté chacun. Aussi, ne jamais changer le support du compartiment milieu lui-même, seulement de l'entourer, et laissez couler sur la barrière de graisse dans le centre.
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Discussion
Dans cette vidéo, nous avons montré comment préparer et entretenir les chambres compartimentées pour une utilisation dans les neurones DRG culture. Fait correctement, ce système permet la séparation des corps de la cellule de l'axone, afin d'étudier les mécanismes par lesquels les neurotrophines signal à travers longs axones. Comme il est l'isolement fluidique entre les compartiments, il permet une stimulation sélective ou le traitement d'un compartiment, sans les autres compartiments touchés. Cultures de chambre à compartiments peuvent soutenir d'autres types cellulaires, y compris des neurones sympathiques du ganglion cervical supérieur, les neurones ganglionnaires de la rétine, et les neurones corticaux. Compréhension spatiale de la transduction du signal neurotrophine peut fournir des indications roman en traitements des maladies neurodégénératives. Plusieurs maladies neurodégénératives, y compris la maladie d'Alzheimer, maladie de Huntington et la maladie des motoneurones, sont associées à des anomalies dans le transport axonal. Des études récentes ont utilisé des chambres microfluidiques au lieu de ces chambres compartimentées. Les chambres microfluidiques 4,5 présentent plusieurs avantages pour l'analyse de l'imagerie.
Des études antérieures ont testé la capacité de ces cultures pour empêcher la diffusion entre l'axone et le compartiment corps cellulaire 1,3,6. Cela peut facilement être testée en ajoutant de faibles concentrations d'un colorant tel que le bleu trypan à un seul compartiment, et regarder pour la diffusion du colorant. Il devrait y avoir peu ou pas de diffusion visibles dans les 24 heures.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier Katharina Cosker et Stephanie Courchesne pour les discussions utiles.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
