Summary
여기서 우리는 지느러미 루트 신경의 culturing 감각 뉴런에 compartmented 회의소 준비 및 유지 관리의 기법을 설명합니다.
Abstract
뉴런은 멀리 대상 - 파생 성장 요소의 연결을 생존과 기능에 필요한 대상 조직을 신경을 분포시키다하는 세포 본체에서 제거됩니다 axonal 프로세스를 확장합니다. Neurotrophins은 특히 감각 뉴런을 innervating의 생존과 분화를 유지하기 위해 필요하지만, 이러한 목표 - 파생 neurotrophins은 innervating 뉴런의 세포 기관에 의사 소통 방법의 문제는 30 년 넘게 적극적인 연구 영역을했습니다. neurotrophin 신호가 세포 신체에 도달하는 방법 중 가장 일반적으로 인정 모델은 신호가 축삭을 따라 retrogradely이 신호를 운반 endosomes 것을 제안합니다. 역행 수송을 연구하기 위해, 문화 시스템은 원래 세포 시신은 axons으로부터 격리하는 로버트 Campenot에 의해 고안되었다. culturing 감각 뉴런의 recapitulates 대상 - 파생 neurotrophins의 생체내 다음 릴리스에서 발생하는 신경 세포 단말기의 선택적 자극에 대해 이러한 compartmented 회의소 준비의 기술. 장거리 미세 소관에 의존 역행 수송을 필요로 역행 신호 이벤트가 neurodegenerative 장애의 치료에 중요한 의미를했습니다.
Protocol
시약의 준비
- 콜라겐 코팅 : 콜라겐 코트 P35 조직 문화 접시 37 오븐에 장소 ° 디바이더를 기름 치는 것 이전 2 일간 C. 콜라겐의 최종 농도는 0.71 MG / 0.001 N HCL에 희석 ML에서해야합니다. 그런 다음, 접시 당 혼합물의 1 ML를 추가합니다.
- 그리스 로더 : 그리스 로더를 작성하기 위해, 60mL 주사기가 처음 코닝 진공 기름으로 가득해야합니다. 45 분 동안 압력솥 후, 그리스 로더를 작성 호일에 포장하고 주사기를 사용합니다.
- 테플론 디바이더 : 디바이더는 각 실험 후 다시 사용할 수 있지만 먼저 제대로 청소해야합니다. 접시에서 분배기를 제거 2 일 황산에 남아있는 기름과 장소를 모두 닦아. 산성에서 제거한 후, 물 3 배, 종기와 린스 20 분, 건조 20 분 유리 p100 페트리 접시와 압력솥의 자리를 수 있습니다.
- N2 - 메틸 셀룰로오스 : 메틸 셀룰로오스의 1.5g을 올리고 돛을 500mL 병에 넣습니다. 저어 표시줄을 추가하고 건조에 20 분 동안 그것을 압력솥 (이 시점에서 모든 작업을 살균해야합니다.) 다음 혈청 무료 미디어 (N 2) 500 MLS를 추가하고, 그것이 해소 때까지 차가운 방에 저어. -20 ° C. 50 ML conicals 및 동결로 나누어지는 -20 ° C.에서 일하는 주식, 1mL 튜브에 50 ML conicals 중 하나 나누어지는 및 동결에 대한
- DRG 미디어 : DMEM, 5 % 히트 inactivated 말 혈청,, 1 %의 페니실린 스트렙토 마이신.
- 100ng/mL DRGN 미디어 : 모두 신경 성장 인자 (NGF)와 두뇌 파생 neurotrophic 요인 (BDNF)의 주식 농도는 1mg/mL입니다. DRG 미디어에 neurotrophins 1:10,000 각 희석. 문화는 NGF 혼자 재배 수 있으며, 이것이 문화에서 살아남기 뉴런의 보완을 바꿀지도 모르겠어.
참고 : 필요한 경우, (사이 토신 arabinoside) AraC의 농도가 1uM 및 0.3uM의 최종 농도에 사용됩니다. 이것은 Schwann 세포와 다른 glia의 성장을 억제합니다. - 10ng/mL DRGN 미디어 : DRG 미디어 100ng/mL DRGN 미디어 (1시 10분)을 희석.
설정에 필요한 그림 1. 도구
(해부하기 전에 1-2일이 과정을 시작합니다) compartmented 회의소 설정
- 밖으로 운동과 함께 콜라겐 코팅 P35 접시의 중앙에 흠집을 만듭니다.
- 처음의 중간에 N2 - 메틸 셀룰로오스의 플레이스 30ul. 분할기가 기름칠 때까지 따로 요리를 설정합니다.
- 그리스 로더에 23 게이지 luer 스텁 어댑터를 연결합니다. 그립 테플론 90 ° 각도 hemostats 한 쌍의로 구분선하고 현미경 아래에 직면하고있는 분할기와 함께 그것이 평평하다. 그리스는 그리스의 연속 라인 (그림 참조)가 너무 때마다 어댑터는 어댑터가 이전 단계에서 그리스에 삽입하는 새로운 출발점에 배치되었는지 확인하고있는 분배기를 추적. 그리스가 전체 구분선에 적용되면 N2 - 메틸 셀룰로오스는 중간 구획 이상하므로, 거꾸로 준비 P35 요리 중 하나를 설정하고 그것을 놓으십시오. 핀셋 한 쌍의와 접시의 바닥에 아래 버튼을 누르십시오. 네 모퉁이 ( "X"로 다이어그램에 표시된 왼쪽 상단, 오른쪽 아래, 오른쪽, 왼쪽 아래)에있는 구분선의 안쪽에 언론에 있는지 확인하십시오.
그림 2 : 구분선을 기름 치는 것 단계
참고 : 그것을 그리스의 음식과 완벽한 도장을 만드는 있도록 단단히 정도로 언론에 중요하지만, 너무 많은 압력이 추가 경우, axons는 측면 구획에 교차하지 않습니다.
, hemostats를 들고 그것을 뒤집 및 구분선을 unclamp. 마지막으로, 단단히 중간 구역의 하단에 초점 현미경 첨부 분할기와 함께 요리를 놓으십시오. 그리스 로더로 세포가 중간 구획에 배치되면 그들이 누설 수 있도록 작은 장벽 (0.25 cm)를 확인하십시오. - 여러 문화, 측면 구획의 각 장소 DRG 미디어와 전지가 유지됩니다되는 배양기에서 위치를 설정하는 데 후. 문화가 몇 시간 동안 앉아 후 누출을 확인할 수 있습니다. 미디어가 중간 구획으로 유출있다면, 다음 문화 사용할 수 없습니다.
참고 : 여러가 새는되므로 먼저 기술을 배우고, 그것이, 실험에 필요한 이상의 문화를 설정하는 것이 중요합니다.
그림 3 : "좋은 VS 새서 '문화
compartmented 문화의 유지 DRG 뉴런
- 1 일 : 100ng/mL DRGN 미디어 + AraC과 측면 구획에서 미디어를 DRG 교체합니다. 절개를 수행하고 중심 구획 (100000 셀)에 세포를 추가합니다.
- 일 2 : 미디어 센터 구획과 그리스의 장벽과 교류를 통해 흐르는 유체 때까지 테플론 분할기의 외부 10ng/mL 미디어 + AraC를 추가합니다.
- 3 일 : 10ng/mL DRGN는 AraC를 생략로 AraC와 서라운드를 생략 100ng/mL DRGN하는 측면 구획에서 미디어를 교체하십시오.
- 일 6 : 1ng/mL + AraC 및 DRG 미디어 + AraC으로 둘러싸고있는 측면 구획에서 미디어를 교체하십시오.
- 일 9 : 실험에 사용.
그림 4 : 세포 기관과 말초 axons의 IHC 이미지
참고 : 미디어를 변경하면, 그것은 각각의 측면 구역의 상단에서 액체를 대기음하는 것이 중요합니다. 또한, 오직 서라운드에서 중간 구획 자체에서 미디어를 변경할 수없고, 그것이 중심에 그리스의 장벽을 통해 흘러가게 마십시오.
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Discussion
이 비디오에서는, 우리는 culturing의 DRG의 뉴런에 사용하기 위해 compartmented 회의소를 준비하고 유지하는 방법을 증명하고있다. 제대로 완료,이 시스템은 neurotrophins 오래 axons에 걸쳐 신호를하는 메커니즘을 연구하기 위해 축삭에서 세포 기관의 분리 수 있습니다. 구획 사이에 유체 절연이 있기 때문에, 그것은 다른 구획에 영향을받지 않고 한 구역의 선택적 자극이나 치료 수 있습니다. Compartmented 챔버 문화는 우수 자궁 경부 신경, 망막 신경절의 뉴런과 뉴런에서 대뇌 피질의 교감 신경 등 다른 세포 유형을 지원할 수 있습니다. neurotrophin 신호 전달의 공간적 이해 neurodegenerative 장애의 치료에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 알츠하이머 병, 헌팅턴의 질환과 운동 신경 질환을 포함한 몇몇 neurodegenerative 장애는, axonal 교통의 결함과 관련 있습니다. 최근 연구 microfluidic 챔버 대신 이러한 compartmented 회의소를 사용했습니다. 4,5 microfluidic 챔버 스는 이미지 분석을위한 몇 가지 장점이 있습니다.
이전 연구는 축삭과 세포 바디 구획 1,3,6 사이의 확산을 방지하기 위해 이들 문화의 능력을 테스트했습니다. 이것은 쉽게 하나의 구획 이러한 trypan 파란색으로 염색의 낮은 농도를 추가하고, 염료의 확산 찾는하여 테스트할 수 있습니다. 24 시간 이내에 볼 수 거의 또는 전혀 보급이 있어야합니다.
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Acknowledgments
우리는 도움이 토론 Katharina Cosker과 스테파니 코세인 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
