Summary
Burada dorsal kök gangliyon kültür duyusal nöronlar için kompartman odaları hazırlanması ve bakımı tekniği açıklar.
Abstract
Nöronlar hedef kaynaklı büyüme faktörleri nöronal hayatta kalma ve işlevi için gerekli olan hedef dokular, çok innerve hücre gövdesi çıkarılır aksonal süreçleri uzatmak. Nörotrofinler özellikle duyusal nöronlar innerve hayatta ve farklılaşma korumak için gereklidir, ancak bu hedef elde edilen nörotrofinler innerve nöron hücre gövdesi nasıl iletişim soru, 30 yılı aşkın bir süredir aktif bir araştırma alanı olmuştur. Nörotrofin sinyalleri hücre gövdesinden nasıl ulaşacağını en yaygın kabul gören model, sinyalizasyon, akson boyunca retrograd bu sinyali taşımak endosomes önermektedir. Retrograd taşıma incelemek üzere, bir kültür sistemi, aslında hücre gövdeleri aksonlar izole edildiği Robert Campenot tarafından icat edildi. Kültür duyusal nöronlar özetlediği hedef kaynaklı nörotrofinler in vivo aşağıdaki sürümde oluşan nöron terminalleri seçici uyarılma için bu kompartman odaları hazırlama tekniği. Uzun menzilli mikrotübül bağımlı retrograd taşıma gerektiren Retrograd sinyalleme olaylarını nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için önemli etkileri vardır.
Protocol
Reaktiflerin hazırlanması
- Kollajen kaplama: kollajen kat p35 doku kültürü plakaları ve bir fırında 37 ° ° C bölücüler yağlama 2 gün önce. Kollajen nihai konsantrasyonu 0,71 mg / ml 0,001 N HCl seyreltilmiş olmalıdır. Daha sonra, plaka başına 1 ml karışımı ekleyin.
- Gres yükleyiciler: gres yükleyici doldurmak için, 60 ml şırınga Corning vakum gres yağı ile dolu olmalıdır. Gres yükleyici doldurmak için 45 dakika otoklavda sonra folyo ile sarın ve şırınga kullanın.
- Teflon bölücüler: bölücüler her bir deney sonrası yeniden kullanılır ama olabilir ilk önce düzgün bir şekilde temizlenmesi gerekir. Plaka bölücü çıkarın, 2 gün boyunca tüm sülfürik asit kalan yağ ve yer silin. Asit çıkardıktan sonra, 20 dakika boyunca, su 3X, kaynatın ile durulayın, kuruması için 20 dakika boyunca bir bardak P100 petri ve otoklav yer sağlamak.
- N2-metilselüloz: metilselüloz, 1.5g tartılır ve bir 500ml şişe yerleştirin. Bir heyecan çubuğuna ekleyin ve kuru zeminde 20 dakika otoklav (bu noktadan itibaren tüm iş steril olmalıdır). Daha sonra, serum serbest medya (N 2) 500 mL ekleyin ve soğuk bir odaya eriyene kadar karıştırın. -20 ° C'de 50 ml conicals ve donma içine kısım -20 ° C'de çalışan hisse senedi, 1 ml tüpler içine 50 ml conicals bir kısım ve dondurma için
- DRG medya: DMEM,% 5 Isı inaktive at serumu ve% 1 penisilin streptomisin.
- 100ng/mL DRGN medya: hem sinir büyüme faktörü (NGF) ve beyin-türevli nörotrofik faktör (BDNF) stok konsantrasyonu 1mg/ml. DRG ortama nörotrofinler 1:10,000 her sulandırınız. Kültürler NGF tek başına büyümüş olabilir, bu kültürlerin hayatta nöronların tamamlayıcı değiştirir.
Not: Gerektiğinde, (sitozin arabinozid) AraC konsantrasyon 1uM ve 0.3uM son bir konsantrasyonda kullanılır. Bu Schwann hücrelerinin ve diğer glia büyümesini engelleyecektir. - 10 ng DRGN medya: 100ng/mL DRGN DRG medya ile medya (1:10) sulandırınız.
Şekil 1 set-up için gerekli Araçlar
(Diseksiyon 1-2 gün önce bu süreci başlatmak) kompartman odaları ayarlama
- Dışa doğru bir hareket ile kollajen kaplı p35 çanak ortasında bir çizik olun.
- Sıfırdan ortasında N2-metilselüloz Yeri 30ul. Bölücü yağlanmış kadar kenara yemekleri ayarlayın.
- Yağ yükleyici 23-gauge luer saplama adaptörü takın. Grip Teflon bir çift ile 90 ° açı hemostat bölücü ve bölücü ile mikroskop altında yukarı bakacak şekilde düz yatıyordu. Gres yağ sürekli bir satırı (bkz. diyagram) olacak şekilde her zaman adaptörü adaptörü, önceki adımda yağ eklenir yeni bir başlangıç noktasında yer olduğunu emin olun bölücü iz. N2-metilselüloz orta bölmesi üzerinden bu nedenle, yağ, tüm bölücü uygulandıktan sonra baş aşağı, hazırlanan p35 yemekleri açmak ve yerleştirmek. Bir cımbız ile çanak alt bastırın. Dört köşe ("X" şemada gösterilen sol üst, sağ alt, sağ üst, sol alt,) bölücü iç basın emin olun.
Şekil 2: bölücü yağlama Adımlar
Not: Bu yağ çanak ile tam bir sızdırmazlık yapar, böylece sıkıca yeterli basın için önemlidir, ama eğer çok fazla baskı eklenir, aksonlar yan bölmeye çapraz olmaz.
Hemostat Pick up ters çevirin ve bölücü çözülme. Son olarak, orta bölmesinin altındaki odaklanarak mikroskop altında sıkıca bağlı bölücü ile çanak yerleştirin. Gres yükleyici ile, hücreleri orta bölmesi yerleştirilir sonra onlar dışarı sızıntı olamayacağını, bu nedenle küçük bir bariyer (0,25 cm). - Pek çok kültürde, yan bölmelerin her yerde DRG medya ve hücrelerin muhafaza edileceği bir kuluçka yer ayarladıktan sonra. Kültürleri, birkaç saat için oturup sonra sızıntı kontrol etmek için izin verin. Medya orta bölmesinin içine sızan varsa, o zaman kültür kullanılamaz.
Not: bu tekniği ilk öğrenirken, birçok sızdıran olacak gibi, bir deney için gerekli olan daha fazla kültürler kurmak için önemlidir.
Şekil 3: "İyi vs sızdıran" kültür
Kompartman kültürler bakımı DRG nöronlar
- 1. Gün: 100ng/mL DRGN medya + AraC ile yan bölümlerinde medya DRG değiştirin. Diseksiyon ve orta bölmesi (100,000 hücreleri) hücreleri ekleyin.
- 2. Gün: medya merkezi bölmesi ile yağ bariyerini ve değişim sıvı üzerinde akana kadar teflon bölücü dışında 10 ng medya + AraC ekleyin.
- 3. Gün: 10 ng DRGN AraC atlayarak AraC ve surround atlayarak 100ng/mL DRGN yan bölümlerinde medya değiştirin.
- 6. Gün: 1ng/mL + AraC ve DRG medya + AraC surround yan bölümlerinde medya değiştirin.
- 9. Gün: deney için kullanın.
Şekil 4: hücre gövdeleri ve distal aksonlar IHC görüntüleri
Not: ortam değiştirirken, her iki tarafında bölmesinin üst sıvı aspire önemlidir. Ayrıca, sadece surround, orta bölmesi kendisi ortamı değiştirmek ve merkezi haline yağ bariyerini üzerinden akmasına izin asla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video, kompartman odaları kültür DRG nöronlar kullanmak için nasıl hazırlamak ve sürdürmek göstermiştir. Düzgün yapılmazsa, bu sistem hangi nörotrofinler uzun aksonlar boyunca sinyal mekanizmaları araştırmak için akson hücre gövdesinden ayrılması sağlar. Bölmeleri arasında akışkan izolasyon olmadığı için, diğer bölmeleri etkilenen olmadan bir kompartmanı seçici uyarılma veya tedavi için izin verir. Kompartman odasına kültürlerin üstün servikal ganglionlar, retina ganglion nöronlar, ve kortikal nöronların sempatik nöronlar da dahil olmak üzere diğer hücre türleri destekleyebilir. Nörotrofin sinyal iletimi Mekansal anlayış nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde yeni bakış açıları sağlayabilir. Alzheimer hastalığı, Huntington hastalığı ve motor nöron hastalığı da dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıklar, aksonal taşımacılığı kusurları ile ilişkilidir. Son çalışmalar, mikroakışkan odaları bu kompartman odaları yerine kullandık. 4,5 mikroakışkan odaları görüntü analizi için çeşitli avantajları vardır.
Önceki çalışmalar, bu kültürlerin akson ve hücre gövdesi bölmesi 1,3,6 arasında yayılmasını engeller yeteneği test ettik . Bu sadece tek bir bölmesi ekleyerek, düşük konsantrasyonlarda tripan mavisi gibi boya ve boya difüzyon için göz kolaylıkla test edilebilir. 24 saat içinde çok az veya hiç görünür difüzyon olmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz, Katharina Cosker ve Stephanie Courchesne yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
