Summary
Qui si descrive la tecnica di preparazione e mantenimento di camere compartimenti per la coltura dei neuroni sensoriali dei gangli delle radici dorsali.
Abstract
I neuroni estendere i processi assoni che sono molto lontane dal corpo cellulare a innervare tessuti bersaglio, dove sono richiesti obiettivi derivati fattori di crescita per la sopravvivenza neuronale e la funzione. Neurotrofine sono specificamente tenuti a mantenere la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni sensoriali che innervano ma il problema di come questi target-derivati neurotrofine comunicare al corpo cellulare dei neuroni che innervano è stata un'area di ricerca attiva da oltre 30 anni. Il modello più comunemente accettata di come i segnali neurotrofina raggiungere il corpo cellulare propone di segnalazione endosomi portare questo segnale retrogrado lungo l'assone. Al fine di studiare il trasporto retrogrado, un sistema di coltura è stato originariamente ideato da Robert Campenot, in cui corpi cellulari sono isolati dal loro assoni. La tecnica di preparazione di queste camere compartimenti per la coltura dei neuroni sensoriali ricapitola la stimolazione selettiva di terminazioni neuronali che si verifica in vivo seguente comunicato del target di derivazione neurotrofine. Retrograda di segnalazione eventi che richiedono lunga distanza retrograda dipendente microtubuli hanno importanti implicazioni per il trattamento di patologie neurodegenerative.
Protocol
Preparazione dei reagenti
- Rivestimento collagene: collagene cappotto p35 piastre di coltura dei tessuti e mettere in forno a 37 ° C per 2 giorni prima ingrassaggio i divisori. La concentrazione finale di collagene deve essere di 0,71 mg / ml diluito in 0,001 N HCl. Poi, aggiungere 1 ml di miscela per piastra.
- Caricatori Grasso: Per riempire il caricatore grasso, una siringa da 60 ml deve prima essere riempita con grasso per vuoto Corning. Usare la siringa per riempire il caricatore grasso, avvolgetela in un foglio e poi in autoclave per 45 minuti.
- Divisori teflon: i divisori possono essere riutilizzati dopo ogni esperimento, ma deve prima essere puliti. Rimuovere il divisore dalla piastra, togliete tutti il grasso residuo e il luogo in acido solforico per 2 giorni. Dopo aver rimosso dal lavaggio, sciacquare con acqua 3X, far bollire per 20 minuti, lasciare asciugare, mettere in un piatto di vetro P100 Petri e autoclave per 20 minuti.
- N2-metilcellulosa: Pesare 1,5 g di metilcellulosa e mettetelo in una bottiglia da 500 ml. Aggiungi un ancoretta e autoclave per 20 minuti a secco (da questo punto tutto il lavoro deve essere sterile). Successivamente, aggiungere 500 ml di siero multimediale gratuito (N 2), e mescolate in una stanza fredda fino a quando non si scioglie. Aliquota in 50 conicals ml e congelare a -20 ° C. Per lavorare stock, aliquota uno dei 50 conicals mL in provette 1 ml e congelare a -20 ° C.
- DRG media: DMEM, 5% di calore siero di cavallo inattivato, streptomicina e 1% di penicillina.
- 100ng/mL DRGN dei media: la concentrazione stock di entrambi fattore di crescita nervosa (NGF) e del cervello-derivato fattore neurotrofico (BDNF) è 1mg/mL. Diluire ciascuna delle neurotrofine 1:10.000 nei media DRG. Culture possono essere coltivate in NGF solo: questo altera il complemento di neuroni che sopravvivono nelle culture.
Nota: Quando necessario, la concentrazione di (citosina arabinoside) AraC è 1um e utilizzato ad una concentrazione finale di 0.3uM. Questo inibire la crescita di cellule di Schwann e glia altri. - 10ng/ml DRGN media: Diluire il 100ng/mL DRGN mezzi di comunicazione (1:10) con i media DRG.
Strumenti di Figura 1. Necessarie per set-up
La creazione di camere di compartimenti (avviare questo processo 1-2 giorni prima della dissezione)
- Fai un graffio nel bel mezzo di un piatto rivestito di collagene p35 con un movimento verso l'esterno.
- 30ul posto di N2-metilcellulosa al centro del graffio. Set piatti da parte fino divisore è ingrassato.
- Allegare una 23-gauge adattatore luer stub al caricatore grasso. Afferrare il divisore in teflon con un paio di hemostats angolo di 90 ° e adagiarlo orizzontalmente con il divisore rivolta verso l'alto sotto un microscopio. Traccia il divisore con grasso facendo in modo che ogni volta che l'adattatore è posto a un nuovo punto di partenza è inserito l'adattatore nella grasso dal passo precedente in modo che ci sia una linea continua di grasso (vedi schema). Una volta che il grasso viene applicato il divisore intero, girare uno dei piatti preparati p35 a testa in giù e posizionarlo in modo che il N2-metilcellulosa si trova sopra il vano centrale. Premere sul fondo del piatto con un paio di pinzette. Assicurarsi di premere sulla parte interna del divisore in quattro angoli (in alto a sinistra, in basso a destra, in alto a destra, in basso a sinistra, indicato nello schema da "X").
Figura 2: Procedura per ingrassare il divisore
Nota: è importante per premere con forza sufficiente in modo che il grasso fa un sigillo completo con il piatto, ma se troppa pressione si aggiunge, gli assoni non attraverserà negli scompartimenti laterali.
Sollevare il hemostats, capovolgerlo e sbloccare il divisore. Infine, posto il piatto con il divisore saldamente sotto il microscopio di messa a fuoco sul fondo del vano centrale. Con il caricatore grasso, fare una piccola barriera (0,25 centimetri) in modo che una volta che le cellule si trovano nel vano centrale non possono fuoriuscire. - Dopo aver creato diverse culture, media luogo DRG in ciascuno dei compartimenti laterali e posto in una incubatrice in cui le cellule saranno mantenute. Lasciare le culture di sedersi per diverse ore e poi verificare la presenza di perdite. Se il supporto è trapelato nel vano centrale, quindi la cultura è inutilizzabile.
Nota: La prima volta che questa tecnica di apprendimento, è importante impostare le culture più di quelli necessari per un esperimento, come molti si perde.
Figura 3: la cultura "Good vs leaky"
Mantenere i neuroni DRG nelle culture compartimenti
- Giorno 1: Sostituire DRG media negli scomparti laterali con 100ng/mL DRGN supporti + AraC. Eseguire la dissezione e aggiungere le celle a scomparto centrale (100.000 cellule).
- Giorno 2: Aggiungi 10ng/ml media + AraC verso l'esterno del divisore Teflon fino a quando il flusso dei media oltre la barriera grasso e liquidi gli scambi con il vano centrale.
- Giorno 3: Sostituire i media nei compartimenti laterali per 100ng/mL DRGN omettendo il Arac e il surround con 10ng/ml DRGN omettendo il AraC.
- Giorno 6: sostituire i media nei compartimenti laterali per 1ng/mL + Arac e il surround con DRG supporti + AraC.
- Giorno 9: Usa per la sperimentazione.
Figura 4: immagini IHC di corpi cellulari e gli assoni distali
Nota: Quando si cambiano i media, è importante per aspirare il liquido dalla parte superiore di ogni singolo vano laterale. Inoltre, non cambia il contenuto del vano centrale stessa, solo dal surround, e lasciate fluire oltre la barriera del grasso verso il centro.
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Discussion
In questo video, abbiamo dimostrato come preparare e mantenere camere compartimenti per l'uso nei neuroni DRG coltura. Fatto correttamente, questo sistema consente la separazione del corpo cellulare dal assone al fine di studiare meccanismi attraverso i quali neurotrofine segnale attraverso lunghi assoni. Poiché non vi è l'isolamento fluidico tra i compartimenti, permette per la stimolazione selettiva o il trattamento di un compartimento senza altri compartimenti essere colpiti. Culture camera compartimentate in grado di supportare altri tipi cellulari tra cui i neuroni simpatici dai gangli cervicale superiore, i neuroni gangliari della retina, e neuroni corticali. Comprensione spaziale di trasduzione del segnale neurotrofina possono fornire indicazioni romanzo in trattamenti di malattie neurodegenerative. Diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer, morbo di Huntington e la malattia dei motoneuroni, sono associate a difetti nel trasporto assonale. Recenti studi hanno usato le camere microfluidica al posto di queste camere compartimentati. Le camere di microfluidica 4,5 hanno diversi vantaggi per l'analisi di imaging.
Precedenti studi hanno testato la capacità di queste culture per prevenire la diffusione tra l'assone e il vano corpo cellulare 1,3,6. Questo può essere facilmente testato con l'aggiunta di basse concentrazioni di un colorante come il blu tripano ad un solo vano, e cercare la diffusione del colorante. Ci dovrebbe essere poca o nessuna diffusione visibile entro 24 ore.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Katharina Cosker e Stephanie Courchesne per utili discussioni.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
