Summary
A continuación se describe la técnica de preparación y mantenimiento de cámaras de compartimentos de las neuronas sensoriales de cultivo de los ganglios de la raíz dorsal.
Abstract
Las neuronas se extienden axones que están muy lejos del cuerpo celular para inervar los tejidos diana, donde objetivo de factores de crecimiento derivados son necesarios para la supervivencia neuronal y la función. Las neurotrofinas son especialmente necesarias para mantener la supervivencia y la diferenciación de las neuronas sensoriales que inervan pero la pregunta de cómo estas neurotrofinas derivadas de objetivos comunicar al cuerpo celular de las neuronas que inervan ha sido un área de investigación activa por más de 30 años. El modelo más comúnmente aceptada de cómo las señales de neurotrofinas llegar al cuerpo de la célula se propone que la señalización endosomas llevar a esta señal de forma retrógrada a lo largo del axón. A fin de estudiar el transporte retrógrado, un sistema de cultivo fue concebido originalmente por Robert Campenot, en el que los cuerpos celulares están aislados de sus axones. La técnica de preparación de estas cámaras de compartimentos para el cultivo de neuronas sensoriales recapitula la estimulación selectiva de terminales de las neuronas que se produce la liberación in vivo de los siguientes derivados de objetivos neurotrofinas. Retrógrada eventos de señalización que requieren transporte a larga distancia microtúbulos retrógrada dependientes tienen importantes implicaciones para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Protocol
Preparación de los reactivos
- Revestimiento de colágeno: el colágeno capa p35 placas de cultivo de tejidos y colocar en un horno a 37 ° C durante 2 días antes de engrasar los divisores. La concentración final de colágeno debe estar en 0,71 mg / ml diluida en 0,001 N HCl. A continuación, añadir 1 ml de la mezcla por placa.
- Cargadores de grasa: A fin de llenar el cargador de grasa, una jeringa de 60 ml debe ser llenado con grasa de vacío Corning. Use la jeringa para llenar el cargador de grasa, lo envuelve en papel de aluminio y luego autoclave durante 45 minutos.
- Separadores de teflón: los separadores se pueden volver a utilizarse después de cada experimento, pero primero debe limpiarse de forma correcta. Retire el separador de la placa, limpie toda la grasa restante y el lugar en ácido sulfúrico durante 2 días. Después de la eliminación del ácido, enjuagar con agua 3 veces, hacer hervir durante 20 minutos, deje que se seque, coloque en un recipiente de vidrio p100 Petri y autoclave durante 20 minutos.
- N2-metil: Pesar 1,5 g de metilcelulosa y colocarlo en un frasco de 500 ml. Añadir una barra de agitación y autoclave durante 20 minutos en seco (a partir de este momento todo el trabajo debe ser estéril). A continuación, añadir 500 ml de suero libre de los medios de comunicación (N 2), y revuelva en una cámara frigorífica hasta que se disuelva. Alícuota en 50 ml conicals y congelar a -20 ° C. Para las acciones de trabajo, alícuota de una de las 50 conicals mL en tubos de 1 ml y congelar a -20 ° C.
- DRG los medios de comunicación: DMEM, 5% de suero de caballo inactivado por calor, y el 1% de penicilina estreptomicina.
- 100ng/mL DRGN los medios de comunicación: La concentración de acciones de ambas factor de crecimiento nervioso (NGF) y el cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF) es 1mg/ml. Diluir cada una de las neurotrofinas 1:10.000 en los medios de comunicación DRG. Las culturas pueden ser cultivadas en NGF solo, lo que altera el complemento de las neuronas que sobreviven en los cultivos.
Nota: Cuando sea necesario, la concentración de (arabinósido de citosina) es AraC 1um y se utiliza a una concentración final de 0.3uM. Esto inhibe el crecimiento de las células de Schwann y la glía otros. - 10ng/ml DRGN los medios de comunicación: Diluir el 100ng/mL DRGN los medios de comunicación (1:10) con los medios de comunicación DRG.
Figura 1. Herramientas necesarias para la puesta en marcha
Configuración de las cámaras de compartimentos (iniciar este proceso de 1-2 días antes de la disección)
- Hacer un rasguño en el medio de un colágeno recubiertas p35 plato con un movimiento hacia afuera.
- 30ul lugar de N2-metil-celulosa en el medio de la nada. Set platos a un lado hasta divisor es engrasada.
- Conecte un adaptador de calibre 23 stub luer al cargador de grasa. Sujete el separador de teflón con un par de pinzas hemostáticas 90 º de ángulo y déjelo con el divisor hacia arriba con un microscopio. Trazar la divisoria con la grasa de asegurarse de que cada vez que el adaptador se coloca en un nuevo punto de partida se inserta el adaptador en la grasa del paso anterior para que haya una línea continua de grasa (ver diagrama). Una vez que la grasa se aplica a la división entera, a su vez uno de los platos preparados p35 boca abajo y colocarlo de modo que el N2-metil-celulosa es el compartimiento medio. Presione sobre el fondo del plato con un par de pinzas. Asegúrese de presionar en el interior de la división en las cuatro esquinas (arriba a la izquierda, abajo a la derecha, parte superior derecha, inferior izquierda, se indica en el diagrama de "X").
Figura 2: Pasos para engrasar el divisor
Nota: Es importante que se mantenga la firmeza necesaria para que la grasa hace que el sellado completo con el plato, pero si la presión se agrega demasiado, los axones no se cruzarán en los compartimientos laterales.
Levante el hemostatos, dale la vuelta y despinzar el divisor. Por último, coloque el plato con el divisor firmemente bajo el microscopio se centra en la parte inferior del compartimento del medio. Con el cargador de la grasa, hacer una pequeña barrera (0,25 cm), de modo que una vez que las células se colocan en el compartimiento medio que no pueda escapar. - Después de haber creado varias culturas, los medios de comunicación en lugar DRG cada uno de los compartimentos laterales y colocar en una incubadora en la que las células se mantendrá. Permita que las culturas a sentarse por varias horas y luego compruebe si hay fugas. Si los medios de comunicación se ha filtrado en el compartimiento del medio, entonces la cultura no se puede utilizar.
Nota: La primera vez que el aprendizaje de esta técnica, es importante crear más cultivos que se necesitan para un experimento, ya que varios se gotean.
Figura 3: "Good vs fugas" cultura
El mantenimiento de las neuronas DRG en las culturas en compartimentos
- Día 1: Reemplazar DRG los medios de comunicación en los compartimientos del lado de los medios de comunicación 100ng/mL DRGN + AraC. Realizar la disección y añadir las células en el compartimiento central (100.000 células).
- Día 2: Agregar 10ng/ml los medios de comunicación + AraC en el exterior de la división de teflón hasta que los medios de comunicación fluye sobre la barrera de grasa y fluido intercambio con el compartimiento central.
- Día 3: Vuelva a colocar los medios de comunicación en los compartimientos de un lado a 100ng/mL DRGN omitiendo el AraC y alrededor de las con 10ng/ml DRGN omitiendo el AraC.
- Día 6: Vuelva a colocar los medios de comunicación en los compartimientos de un lado a 1ng/ml + AraC y rodearse de los medios de comunicación DRG + AraC.
- Día 9: El uso de la experimentación.
Figura 4: las imágenes IHC de los cuerpos celulares y axones distales
Nota: Al cambiar los medios de comunicación, es importante para aspirar el líquido de la parte superior del compartimento de cada lado. Además, nunca cambiar los medios de comunicación desde el compartimento del medio en sí, sólo desde la rodean, y dejar que fluya sobre la barrera de grasa en el centro.
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Discussion
En este video, nos han demostrado cómo preparar y mantener cámaras de compartimentos para su uso en el cultivo de neuronas DRG. Hecho correctamente, este sistema permite la separación del cuerpo celular del axón con el fin de estudiar los mecanismos por los cuales las neurotrofinas señal a través de los axones largos. Dado que no es el aislamiento de fluidos entre los compartimientos, permite la estimulación selectiva o el tratamiento de un compartimiento sin los otros compartimientos se vean afectados. Culturas compartimentados cámara puede soportar otros tipos de células incluyendo neuronas simpáticas de los ganglios cervicales superiores, las neuronas ganglionares de la retina y las neuronas corticales. Comprensión espacial de la transducción de señales de neurotrofinas pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre los tratamientos de los trastornos neurodegenerativos. Varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y la enfermedad de la neurona motora, están asociados con defectos en el transporte axonal. Estudios recientes han utilizado cámaras de microfluidos en lugar de estas cámaras de compartimentos. Las cámaras de 4,5 microfluidos tienen varias ventajas para el análisis de imágenes.
Estudios anteriores han probado la capacidad de estas culturas para evitar la difusión entre el axón y el compartimiento del cuerpo de la célula 1,3,6. Esto puede ser probado mediante la adición de bajas concentraciones de un medio de contraste, como azul de tripano a un compartimiento único, y buscar la difusión del colorante. Debe haber poca difusión o no visibles dentro de las 24 horas.
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Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Katharina Cosker Courchesne y Stephanie útil para los debates.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
