Summary
כאן אנו מתארים את הטכניקה של הכנת ושמירה לתאי מחולקים עבור נוירונים culturing חושית של הגרעינים השורש הגבי.
Abstract
נוירונים להאריך תהליכים axonal כי הם רחוקים בגוף התא innervate רקמות היעד, שם היעד הנגזרות גורמי גדילה נדרשים להישרדות תפקוד עצבי ו. Neurotrophins נדרשים במיוחד כדי לשמור על בידול של הישרדות innervating עצב סנסורי אבל השאלה כיצד אלה יעד הנגזרות neurotrophins לתקשר אל גוף התא של הנוירונים innervating כבר על שטח של מחקר פעיל במשך 30 שנים. המודל המקובל בדרך כלל של כמה אותות neurotrophin להגיע לגוף התא מציעה כי איתות endosomes לשאת אות retrogradely לאורך האקסון. כדי ללמוד התחבורה מדרדר, מערכת התרבות פותחה במקור על ידי רוברט Campenot, שבו גופי התא מבודדים האקסונים שלהם. הטכניקה של הכנת אלה מחולקים לתאי עבור culturing נוירונים משחזר את הגירוי החושי סלקטיבית של מסופי נוירון המתרחשת בעקבות שחרור vivo של יעד הנגזרות neurotrophins. אירועים איתות מדרדר הדורשים ארוכי טווח תחבורה תלויה microtubule מדרדר להיות השלכות חשובות בטיפול בהפרעות ניוון עצבי.
Protocol
הכנה של ריאגנטים
- ציפוי קולגן: קולגן מעיל P35 רקמה תרבות צלחות ומכניסים לתנור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים לפני שמון חוצצים. הריכוז הסופי של קולגן צריך להיות 0.71 מ"ג / מ"ל מדולל ב .001 N HCl. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של תערובת לכל צלחת.
- מעמיסים גריז: כדי למלא את מטעין גריז, מזרק 60mL תחילה יש מלא שומן ואקום קורנינג. השתמש במזרק כדי למלא את מטעין גריז, לעטוף אותה בנייר כסף ואז החיטוי במשך 45 דקות.
- טפלון חוצצים: חוצצים ניתן שימוש חוזר לאחר כל ניסוי, אך תחילה יש לנקות כראוי. הסר את המחיצה מהצלחת, לנגב את כל השומן הנותר ומניחים חומצה גופרתית עבור 2 ימים. לאחר הסרת מן החומצה, לשטוף עם מים לרתיחה 3X, במשך 20 דקות, לאפשר לו להתייבש, מקום צלחת פטרי P100 זכוכית החיטוי במשך 20 דקות.
- N2-methylcellulose: לשקול את 1.5g של methylcellulose ולמקם אותו בתוך בקבוק 500ml. הוספת בר מערבבים החיטוי אותו במשך 20 דקות על יבש (מנקודה זו כל העבודה חייב להיות סטרילי). לאחר מכן, להוסיף 500 MLS של נסיוב חינם התקשורת (N 2), ומערבבים בחדר קר עד שהוא נמס. Aliquot לתוך 50 מ"ל conicals ולהקפיא ב -20 ° C. עבור aliquot עובד המניות, אחד conicals 50 מ"ל לתוך צינורות 1mL ולהקפיא ב -20 ° C.
- DRG התקשורת: DMEM, 5% סוס מומת חום בדם, ו -1% סטרפטומיצין פניצילין.
- 100ng/mL DRGN התקשורת: ריכוז המניות של שניהם גורם גדילה עצבי (NGF) ואת המוח נגזר גורם neurotrophic (BDNF) הוא 1mg/mL. מדולל לכל אחד neurotrophins 1:10,000 לתוך התקשורת DRG. תרבויות ניתן לגדל NGF לבד, זה משנה את המשלים של נוירונים לשרוד התרבויות.
הערה: בעת הצורך, ריכוז (ציטוזין arabinoside) AraC הוא 1uM בשימוש בריכוז הסופי של 0.3uM. זה יהיה לעכב את הצמיחה של תאים שוואן ואת גליה אחרים. - 10ng/mL DRGN התקשורת: לדלל את DRGN 100ng/mL מדיה (01:10) עם התקשורת DRG.
באיור 1. כלים הדרושים הגדרת
הגדרת לתאי מחולקים (להתחיל את התהליך הזה 1-2 ימים לפני הניתוח)
- הפוך לגרד באמצע צלחת מצופה קולגן P35 עם תנועה כלפי חוץ.
- המקום 30ul של methylcellulose-N2 על באמצע השריטה. סט צלחות בצד עד המחיצה הוא משומן.
- צרף מתאם 23-מד בדל luer כדי מטעין את המשחה. את מחיצת גריפ טפלון עם זוג 90 ° hemostats זווית ולהניח אותה שטוח עם מחיצת פונה כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ. עקוב אחר המפריד עם גריז לוודא כי בכל פעם מתאם ממוקם בנקודת התחלה חדשה מתאם מוכנס לתוך שומן מן השלב הקודם, כך שיש קו רציף של שומן (ראה תרשים). לאחר גריז מוחל על המחיצה כולה, להפוך לאחד P35 מאכלים מוכנים הפוכים ולמקם אותו כך N2-methylcellulose נגמר בתא באמצע. לחץ כלפי מטה על תחתית צלחת עם פינצטה. הקפד ללחוץ על החלק הפנימי של המחיצה בארבע פינות (השמאלית העליונה, בפינה הימנית התחתונה, הימנית העליונה, השמאלית התחתונה, המצוין בתרשים על ידי "X").
איור 2: צעדים כדי לשמן את המחיצה
הערה: חשוב ללחוץ בחוזקה מספיק כך גריז עושה חותם להשלים עם המנה, אבל אם יותר מדי לחץ נוסף, האקסונים לא לחצות את הגבול לתוך התאים בצד.
תרימי את hemostats, להפוך אותו שוב unclamp המפריד. לבסוף, במקום צלחת עם מחיצת מחובר היטב מתחת למיקרוסקופ התמקדות התחתון של התא האמצעי. עם מטעין את השומן, ליצור מחסום קטן (0.25 ס"מ), כך שברגע התאים ממוקמים בתא באמצע שהם לא יכולים לדלוף החוצה. - לאחר להגדיר כמה תרבויות, DRG מקום התקשורת בכל התאים בצד ומקום באינקובטור שבו התאים יישמר. אפשר התרבויות לשבת במשך כמה שעות ואז לבדוק דליפה. אם בתקשורת יש דלף לתוך התא האמצעי, אז התרבות הוא שמיש.
הערה: כשבני הראשון לומדים את הטכניקה הזו, חשוב להגדיר תרבויות יותר יש צורך בניסוי, כמו כמה יהיה דולף.
איור 3: "טוב לעומת דולף" תרבות
נוירונים DRG שמירה בתרבויות מחולקים
- יום 1: החלף DRG התקשורת התאים לצד 100ng/mL DRGN מדיה + AraC. בצע לנתיחה ולהוסיף תאים לתא מרכז (100,000 תאים).
- יום 2: הוסף 10ng/mL מדיה + AraC החיצוני של המחיצה טפלון עד שהתקשורת זורמת מעל המכשול שומן ונוזלים חילופי עם תא מרכז.
- יום 3: החלף התקשורת התאים צד 100ng/mL DRGN השמטת AraC ואת להקיף עם 10ng/mL DRGN השמטת AraC.
- יום 6: החלף התקשורת התאים צד 1ng/mL + AraC ואת להקיף עם DRG מדיה + AraC.
- יום 9: השתמש לניסויים.
איור 4: תמונות של גופות IHC התא אקסונים דיסטלי
הערה: כאשר משנים את התקשורת, חשוב לשאוב את הנוזל מהחלק העליון של תא אחד בצד. כמו כן, לא לשנות את התקשורת מן התא האמצעי עצמו, רק להקיף את, ולתת לו לזרום מעל המכשול גריז למרכז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו הוכיחו כיצד להכין ולתחזק לתאי מחולקים לשימוש נוירונים DRG culturing. בוצע כהלכה, מערכת זו מאפשרת הפרדה בין גוף התא של האקסון כדי ללמוד על המנגנונים שבאמצעותם neurotrophins אותות מעבר אקסונים ארוכים. מאז יש בידוד fluidic בין התאים, היא מאפשרת גירוי טיפול סלקטיבי או של תא אחד ללא התאים האחרים להיות מושפע. תרבויות מחולקים קאמרית יכול לתמוך סוגי תאים אחרים, כולל נוירונים אוהדת בגרעיני צוואר הרחם מעולה, הנוירונים הגנגליון ברשתית, ועל נוירונים בקליפת המוח. הבנה מרחבית של הולכת אותות neurotrophin עשויה לספק תובנות לתוך הרומן טיפולים של הפרעות ניווניות. הפרעות ניווניות שונות, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת הנטינגטון ומחלות הנוירון המוטורי, המשויכים פגמים תחבורה axonal. מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בתאי microfluidic במקום אלה מחולקים לתאי. חדרי microfluidic 4,5 יש כמה יתרונות לניתוח הדמיה.
מחקרים קודמים בחנו את היכולת של תרבויות אלה כדי למנוע דיפוזיה בין האקסון לגוף התא תא 1,3,6. זה יכול בקלות להיות נבדק על ידי הוספת ריכוזים נמוכים של צבע כגון trypan כחול לתא אחד בלבד, ולחפש דיפוזיה של צבען. לא צריך להיות דיפוזיה קטנה או לא גלוי בתוך 24 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות קתרינה Cosker וסטפני Courchesne לדיונים מועילים.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
