Summary
Здесь мы опишем технику подготовки и поддержания отсеки камеры для культивирования сенсорных нейронов спинного ганглиев корня.
Abstract
Нейроны расширить аксонального процессы, которые далеки от тела клетки к иннервируют тканях-мишенях, где целевая полученных факторов роста, необходимых для выживания нейронов и функции. Нейротрофинов специально обязаны поддерживать выживание и дифференциации иннервирующих сенсорных нейронов, но вопрос о том, как эти целевые полученных нейротрофинов сообщает тела клетки нейронов, иннервирующих была областью активных исследований на протяжении более 30 лет. Наиболее общепринятой моделью того, как нейротрофина сигналы достигают тела клетки предлагает сигнализации эндосомы нести этот сигнал ретроградно вдоль аксона. С целью изучения ретроградного транспорта, культуры система первоначально была разработана Робертом Campenot, в которых клетка тела изолированы от своих аксонов. Техника подготовки этих отсеки камеры для культивирования сенсорных нейронов повторяет селективной стимуляции нейронов терминалов, что происходит в естественных условиях после выпуска целевых полученных нейротрофинов. Ретроградная сигнализация событий, требующих дальнего микротрубочек зависящих транспортных ретроградной иметь важные последствия для лечения нейродегенеративных расстройств.
Protocol
Подготовка реагентов
- Коллаген покрытие: коллаген пальто p35 культуре ткани пластин и поместить в духовку при температуре 37 ° С в течение 2 дней до смазки перегородок. Конечная концентрация коллагена должны быть в 0,71 мг / мл разведенного в 0,001 N HCl. Затем добавьте 1 мл смеси на чашку.
- Смазка погрузчики: Для того, чтобы заполнить смазкой погрузчика, 60 мл шприца сначала должен быть заполнены смазкой вакуумных Corning. Используйте шприц для заполнения смазкой погрузчик, заверните его в фольгу, а затем автоклаве в течение 45 минут.
- Тефлон делителей: Делители могут быть использованы повторно после каждого эксперимента, но сначала должен быть надлежащим образом очищены. Удалить делителя с пластинки, вытрите все оставшиеся жир и место в серной кислоте в течение 2 дней. Сняв с кислотой, промыть водой 3X, кипятить 20 минут, дать высохнуть, поместите в стеклянную p100 Петри и автоклаве в течение 20 минут.
- N2-метилцеллюлозы: отвесить 1,5 г метилцеллюлозы и поместить его в 500 мл бутылки. Добавить мешалкой и автоклава в течение 20 минут на сухой (с этой точки все работы должны быть стерильными). Затем добавьте 500 мл сыворотки свободных средств массовой информации (N 2), и движение в холодной комнате, пока он не растворится. Алиготе в 50 мл conicals и заморозить при -20 ° C. Для работы акции, аликвоту одного из 50 мл в 1 мл conicals трубы и замерзать при -20 ° C.
- DRG СМИ: DMEM, 5% тепла инактивированной лошадиной сыворотки и 1% пенициллина стрептомицин.
- 100ng/mL DRGN СМИ: фондовый концентрации как фактор роста нервов (ФРН) и мозгового нейротрофического фактора (BDNF) является 1mg/mL. Развести каждый из нейротрофинов 1:10000 в DRG СМИ. Культуры могут быть выращены в NGF в одиночку, это меняет дополнение нейронов, которые выживают в культуре.
Примечание: При необходимости концентрации (цитозинарабинозид) AraC является 1 мкм и использоваться при конечной концентрации 0.3uM. Это будет тормозить рост клеток Шванн и другие глии. - 10ng/mL DRGN СМИ: Развести 100ng/mL DRGN СМИ (1:10) со средствами массовой информации DRG.
Рисунок 1. Инструменты, необходимые для ввода в эксплуатацию
Настройка отсеки камер (начать этот процесс за 1-2 дня до вскрытия)
- Сделать нуля в середине коллагена покрытием p35 блюдо с внешним движением.
- Место 30ul из N2-метилцеллюлозы на середине нуля. Установить блюда в сторону, пока делителя смазаны.
- Прикрепить 23 калибра Luer адаптер кабеля, идущего к смазкой погрузчика. Возьмитесь за делителя тефлон с парой углом 90 ° hemostats и положите его плашмя с делителя вверх под микроскопом. Трассировка делителя смазкой убедившись, что каждый раз, когда адаптер устанавливается на новую точку отсчета Адаптер вставляется в жир из предыдущего шага, так что существует непрерывная линия смазкой (см. схему). Как только смазка применяется ко всему делителя, включите одну из подготовленных p35 блюда с ног на голову и поместите его так N2-метилцеллюлозы составляет более среднего отсека. Нажмите на дно тарелки с пинцетом. Убедитесь, что нажали на внутренней стороне делителя в четырех углах (верхняя левая, нижняя правая, верхняя правая, нижняя левая, указанным в диаграмме "X").
Рисунок 2: Шаги для смазывания делителя
Примечание: Очень важно, чтобы пресса достаточно крепко, так что жир делает полную герметизацию с блюдо, но если слишком много давления добавил, аксоны не будет пересекать в боковые отсеки.
Возьмите hemostats, перевернуть его и разжимать делителя. И наконец, место блюдо с делителя прочно прикреплены под микроскопом акцентом на нижней части среднего отсека. С жиром погрузчик, сделать небольшой барьер (0,25 см), так что, как только клетки помещаются в среднем отсеке, они не могут просочиться наружу. - После того, как создали несколько культур, место DRG СМИ в каждой из бортовых отсеков и место в инкубаторе, в котором клетки будут сохранены. Разрешить культур, чтобы сидеть в течение нескольких часов, а затем проверить на наличие утечек. Если средства массовой информации просочились в среднем отсеке, то культура является непригодным для использования.
Примечание: При первом обучения этой технике, очень важно создать более культур, чем нужно для эксперимента, так как ряд будет вытекающих.
Рисунок 3: «Хорошие результаты против вытекающей" культура
Поддержание DRG нейроны в отсеки культур
- День 1: Замените DRG средств массовой информации в бортовых отсеков с 100ng/mL DRGN СМИ + AraC. Выполнить вскрытие и добавления ячеек в центр отсека (100 000 клеток).
- День 2: Добавить 10ng/mL СМИ + AraC для внешнего делителя тефлон, пока СМИ потоков через барьер жира и обмена жидкости с центром отсека.
- День 3: Замените средств массовой информации в бортовых отсеков для 100ng/mL DRGN опустив AraC и окружить 10ng/mL DRGN опустив AraC.
- День 6: Замените средств массовой информации в бортовых отсеков для 1ng/mL + AraC и окружить DRG СМИ + AraC.
- День 9: Используйте для экспериментов.
Рисунок 4: IHC изображения клеточных тел и дистальных аксонов
Примечание: При изменении медиа, важно для аспирации жидкости из верхней части каждой стороны отсека. Кроме того, никогда не меняются СМИ с середины отсека, а только от окружающих, и пусть он обтекании смазки барьер в центре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео, мы показали, как готовить и поддерживать отсеки камеры для использования в нейронах DRG культивирования. Было сделано правильно, эта система позволяет разделение тела клетки от аксона с целью изучения механизмов, посредством которых нейротрофинов сигнала на большие аксонов. Так как жидкостный изоляцию между отсеками, оно позволяет для селективной стимуляции или лечение одного отсека без остальных отсеков вреда для себя. Культур на отсеки, камера может поддерживать другие типы клеток, в том числе симпатических нейронов из верхних шейных ганглиев, нейронов сетчатки ганглия, и корковые нейроны. Пространственное понимание передачи сигнала нейротрофина может предоставить новые идеи в лечении нейродегенеративных расстройств. Несколько нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и заболевания двигательных нейронов, которые связаны с дефектами в аксонального транспорта. Недавние исследования использовались микрожидкостных камерах вместо того, чтобы эти отсеки камер. Микрожидкостных камеры 4,5 имеют ряд преимуществ для работы с изображениями анализа.
Предыдущие исследования протестировали способность этих культур для предотвращения диффузии между аксонов и отсек ячейки тела 1,3,6. Это можно легко проверить, добавив низкие концентрации красителя, таких как трипанового синего до одного отсека только и ищите диффузии красителя. Там должно быть мало или нет видимых диффузии в течение 24 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Катарина Cosker и Стефани Courchesne за полезные обсуждения.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
