Summary
Este es un protocolo que describe cómo aislar y cultivar primaria neuronas simpáticas de los ganglios cervical superior (SCG) de las crías recién nacido.
Abstract
Los ganglios cervical superior (SCG) en las ratas son pequeños, brillantes, con forma de almendra estructuras que contienen las neuronas simpáticas. Estas neuronas proporcionan inervación simpática de la cabeza y el cuello y las regiones que constituyen una población bien caracterizados y relativamente homogénea (4). Las neuronas simpáticas dependen de factor de crecimiento nervioso (NGF) para el crecimiento de la supervivencia, diferenciación y axonal y de la amplia disponibilidad de NGF facilita su cultura y su manipulación experimental (2, 3, 6). Por estas razones, cultivos de neuronas simpáticas se han utilizado en una amplia variedad de estudios, incluyendo el desarrollo neuronal y la diferenciación, los mecanismos de muerte celular programada y patológica, y la transducción de señales (1, 2, 5 y 6). La disección de los SCG de ratas recién nacidas y las neuronas simpáticas de cultivo no es muy complicada y se puede dominar con bastante rapidez. En este artículo vamos a describir en detalle cómo diseccionar el SCG de crías de rata recién nacida y de utilizarlos para establecer cultivos de neuronas simpáticas. El artículo también se describen los pasos preparatorios y de los diversos reactivos y equipos que se necesitan para lograr este objetivo.
Protocol
1. Preparación para la disección:
- Seleccione la placa de cultivo apropiado (10 cm o placas de 6 pocillos o bien 24, etc) dependiendo de la naturaleza de sus experimentos, y el escudo con el colágeno de cola de rata-24 horas antes de la disección. Los métodos para la preparación de cola de rata colágeno y usarlo para placas de cultivo abrigo se han descrito en otra parte (1).
- Prepare una solución de tripsina 0,25% en tampón fosfato salino (PBS) (sin EDTA) y el filtro de esterilización. Preparar alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 º C.
- Prepare una solución que contiene 2.5 mM de cada uno de uridina y 5 FDU-en agua destilada / desionizada H 2 O. Filtro a esterilizar y preparar alícuotas de 50 microlitros. Conservar a -20 º C.
- Preparar medio completo: RPMI 1640 medio de cultivo con 10% inactivado por calor suero de caballo (el calor inactiva por incubación en un baño de agua a 56 º C durante 30 minutos) y el 5% de suero fetal bovino.
- Prepare final Medium: RPMI 1640 medio de cultivo con 1% inactivado por calor suero de caballo + NGF (concentración 100ηg/ml final) + penicilina / estreptomicina (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU solución (10 mM concentración final) . Nota: este medio debe estar compuesto por nuevos antes de su uso en todo momento. Para un experimento en un formato de placa de 24 pozos, uno tendrá que preparar 12 ml de este medio. Se recomienda que se prepare un poco más. NGF se pueden comprar en una variedad de fuentes comerciales (véase el cuadro al final de este protocolo).
- Equipamiento: Un necesita un microscopio de disección y fuente de luz. Un iluminador de cuello de cisne de fibra óptica doble con puntas de enfoque es preferible. Además, será necesario limpiar y esterilizar (autoclave o por inmersión en etanol al 70% por lo menos 20 minutos) las herramientas de disección: dos pares de micro-disección pinzas de acero inoxidable, y un par de tijeras de disección (también de acero inoxidable y tanto desde Roboz). Dos agujas de jeringas estériles (26 gague x 1 ½ pulgadas o similar) también será necesario. Es necesario establecer una tabla de disección, que es un 3 "x3" pedazo de espuma de poliestireno envueltos en papel de aluminio y cubierta con una Kimwipe. Rocíe el tablero con etanol al 70% para descontaminar. Por último, la preparación del fuego pulido pipeta de vidrio de los pastos. Con el fin de pulir al fuego, tomar la pipeta de vidrio y sostenga la punta de la llama durante unos segundos, durante la rotación. Tras la inspección, la punta se verá más suave y la apertura será más estrecho. Esto es necesario para el paso en el que las células se disocian. Realizar fuego pulido en una campana de cultivos celulares para que la pipeta se mantiene estéril.
2. La disección del ganglio cervical superior:
- Recoger cachorros recién nacidos de ratas que están en edad de P0 o P1.
- Limpie rápidamente el cachorro para la disección con el 70% de etanol para reducir las posibilidades de contaminación.
- Rápidamente decapitar a las crías con un par de tijeras afiladas (este paso no se muestra en el video). Mantenga la cabeza con una pinza estéril contra una gasa estéril para drenar el exceso de sangre brevemente.
- Coloque la cabeza sobre la almohadilla de la disección con la parte ventral hacia arriba y el extremo caudal orientada hacia usted. La tráquea cortada debe ser fácilmente visible. Use las agujas de jeringas estériles para asegurar la cabeza cortada a la plataforma de la disección de la siguiente manera: empujar una de las patas cuando el techo de la boca en la almohadilla y empuje el pasador de segundo, aunque la tráquea cortada en la almohadilla. Coloque la almohadilla bajo el microscopio de disección y comenzar la disección.
- Usando ambas pinzas (una en cada mano) la piel clara de distancia y la grasa alrededor de la tráquea, teniendo cuidado de no profundizar demasiado. Haciendo esto expondrá un par de músculos que van casi en paralelo el uno al otro a ambos lados de la tráquea. Nota: durante la disección, tendrá que regar con agua fría o caliente PBS estéril, libre de suero RPMI 1640 que entrega con una pipeta Pasteur para quitar el exceso de sangre y para mantener el área limpia y húmeda. Esto se puede hacer sólo una vez o varias veces dependiendo de la velocidad se trabaja. Por un disector de la experiencia, sólo se tarda de dos a tres minutos para diseccionar un par de ganglios.
- Use las pinzas para cortar y extirpar el músculo en un lado primero.
- Una vez que el músculo se elimina, la arteria carótida se hará visible. A menudo, es la luz rosada y contiene la sangre. Puede aparecer un color más claro que otros vasos sanguíneos que puede ver en los alrededores y por esta razón, la arteria carótida puede no ser evidente de inmediato. Esta arteria corre a lo largo de la tráquea y se bifurca en lo que parece una "Y" en forma de cinta. Esta bifurcación es un hito importante y una vez que se encuentra, será relativamente fácil encontrar el SCG.
- Cortar la arteria en el extremo más caudal y subirlo un poco con la pinza (el otro extremo todavía está conectado). Una vez hecho esto, podrás ver una forma de almendra, brillante en masa buscando pequeñas de tejido que se unen libremente a la arteria justo en el punto de bifurcación y que ha tread-como pre-y / o post-ganglionares de enlace. Este es el ganglio cervical superior. Use un segundo par de pinzas en la otra mano para separar suavemente y colóquelo en un plato de cultivo pequeño (35 mm) con frío, el suero libre de RPMI 1640.
- A continuación, extraer el ganglio en el otro lado de la tráquea, siguiendo el mismo protocolo.
3. Limpieza de los ganglios:
- Una vez que todos los ganglios han sido diseccionados, que debería ser liberado lo más posible de tejido extraño.
- Bajo el microscopio de disección, se puede ver que los ganglios se han unido las piezas de la arteria carótida, el tejido adiposo o de otro tipo. Trabajar con fórceps en cada mano para burlarse de distancia estos materiales no deseados. Lugar limpiar los ganglios en una estéril cónicos 15 ml, tubo de polipropileno, que contiene medio RPMI 1640.
- Los conectores pre-y / o post-ganglionares también debe ser recortada. Cada ganglio tiene alrededor de 10.000 neuronas. Una vez que las neuronas están recubiertos, que volverá a crecer sus neuritas.
4. El establecimiento de la cultura neuronas simpáticas:
- Centrífuga de los ganglios en 200xg durante 2 minutos y descartar el sobrenadante.
- Resuspender los ganglios en 0,5 a 1 ml de solución de tripsina 0,25%. Colocar en un baño de agua a 37 ˚ C o una incubadora durante 30 minutos. Esto le ayudará a disociar las células de los ganglios.
- Después de 30 minutos, agregar 10 ml de medio completo para diluir y neutralizar la tripsina y centrifugar a 200xg durante 2 minutos.
- Desechar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de medio final.
- Además se disocian las células de trituración de los ganglios arriba y hacia abajo con el fuego-pulido pipeta de vidrio de los pastos. Triturar los ganglios de 20 veces y colocar el tubo en hielo durante unos minutos.
- Mientras tanto, el fuego a pulir la pipeta más para hacer la abertura más estrecha (aproximadamente 2 / 3 y 1 / 2 mm de diámetro). Espere unos minutos hasta que se enfríe y triturar los ganglios 20 veces más. A medida que continúe el medio serán cada vez más nublado que indica que las células se están disociados. Repita este paso una o dos veces más, dependiendo de lo bien que las células se disocian. Después de algún tiempo, te darás cuenta de que todos los ganglios se han disociado en las neuronas de los ganglios y no intacto son visibles en el tubo. Puede haber un poco de material tejido que no se disocian. En este punto, el tubo se sientan en el hielo durante unos minutos para que todos los residuos no disociado puede asentarse en el fondo. Ahora, recoger cuidadosamente casi todo el medio de la parte superior y colocar en otro tubo. Para asegurarse de que no recogen los restos sin disociar, deje unos 50 l en la parte inferior del tubo. Añadir más de medio final al tubo que contiene las células disociadas: este volumen depende del tipo de una placa de cultivo se utiliza para la cultura de las neuronas. Por ejemplo: si un plato de 24 y se va a emplear, a continuación, la placa de 0,5 ganglios por pozo (~ 10.000 neuronas por pocillo) en 0,5 ml de medio final por pocillo. Una camada de ratas típica consta de 12 crías, lo que daría 24 ganglios. Esto es suficiente para sembrar un 24 y placa y el volumen total de medio final es de 12 ml. Nota: los ganglios también contienen una pequeña población de células gliales y otros tipos de células que estarán presentes en la cultura. Utilizando Uridine/5-FDU en el medio final evitará su proliferación y promover su muerte.
- Alimentación de las celdas cada 48 horas mediante la sustitución de 2 / 3 de la media con un fresco RPMI% suero de caballo + NGF y uridine/5-FDU. Nota: Al principio, la cultura contiene las neuronas simpáticas que mirar a su alrededor sin neuritas. Neuritas cortas se hacen visibles 24 horas después de la disección y se tornan progresivamente más denso y ramificado en el tiempo.
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Discussion
Utilizamos ratas Sprague Dawley, de nuestras culturas.
Tómese su tiempo y atención a la limpieza de los ganglios. Eliminar todos los restos, los vasos sanguíneos y grasa. Este paso es importante para asegurar una cultura que es más o menos homogénea y libre de los tipos de células extrañas. La adición de uridine/5-FDU gran medida eliminar cualquier resto de las células no neuronales (mitosis) contaminación de la cultura o al menos inhibir su proliferación.
Además, durante el paso de la disociación, ser paciente y tomar el tiempo para separar las neuronas para que no se encuentran en grandes grupos, una vez que se siembran en las placas. Tener grandes cúmulos de células no dará buenos resultados experimentales. Por ejemplo, los grupos grandes que hacen difícil que las neuronas que se transfectadas o infectadas. Inmunotinción también puede verse obstaculizada y los experimentos que requieren contar las neuronas, será difícil llevar a cabo, también.
No es necesario para complementar el medio con penicilina / estreptomicina cada vez que las culturas se alimentan. Además del tiempo de penicilina / estreptomicina primera las células son colocadas es suficiente. Agregue uridine/5-FDU fresco para el medio cada vez que se cambia el medio.
Hemos utilizado la cultura neuronal simpática para estudiar la apoptosis en respuesta a la retirada de NGF. Por ejemplo, en Biswas et al. 2007 (2), las neuronas simpáticas fueron transfectadas con siRNA contra varias moléculas que juegan un papel importante en la promoción de la apoptosis. Deckwerth et al. 1996 (5) han utilizado las neuronas simpáticas de los ratones de tipo salvaje y ratones que carecían del gen pro-apoptóticos, Bax. Se han analizado cómo estas neuronas se comportan cuando se les priva de NGF. Figura 6 de Biswas et al. 2007 (2) y la Figura 3 de Deckwerth et al. 1996 (5) muestran lo que transfectadas y no transfectadas culturas neuronal simpática apariencia, respectivamente.
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Acknowledgments
NZ gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de Subhas Biswas, Andrew Sproul, y Willet Ryan por su formación en la disección y la cosecha de las neuronas simpáticas. Apoyado por becas de los NIH, NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
