Summary

Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)

Published: January 30, 2009
doi:

Summary

Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.

Abstract

Os gânglios cervical superior (GCS) de ratos são pequenos, brilhantes, em forma de amêndoa estruturas que contêm neurônios simpáticos. Esses neurônios fornecem inervação simpática para a cabeça e pescoço e constituem uma população bem caracterizados e relativamente homogêneo (4). Neurônios simpáticos são dependentes de fator de crescimento neural (NGF) para a diferenciação, sobrevivência e crescimento axonal ea propagação de grande disponibilidade de NGF facilita sua cultura e manipulação experimental (2, 3, 6). Por estas razões, cultivadas neurônios simpáticos têm sido utilizadas em uma ampla variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento neuronal e diferenciação, os mecanismos de morte celular programada e patológicos, e transdução de sinal (1, 2, 5 e 6). Dissecando o SCG de ratos recém-nascidos e neurônios simpáticos cultura não é muito complicado e pode ser dominada com bastante rapidez. Neste artigo, iremos descrever em detalhes como dissecar o SCG de filhotes de rato recém-nascido e para usá-los para estabelecer culturas de neurônios simpáticos. O artigo também descreve as etapas preparatórias e os vários reagentes e equipamentos que são necessários para alcançar este objectivo.

Protocol

1. Preparação para a dissecação: Selecione o prato de cultura apropriado (10 cm ou placas de seis poços ou 24 poços, etc), dependendo da natureza de suas experiências, e revesti-los com rat tail-colágeno 24 horas antes da dissecção. Os métodos para a preparação de rato-cauda de colágeno e usá-lo para placas de cultura de revestimento têm sido descritos em outra parte (1). Prepare uma solução de tripsina 0,25% em tampão fosfato salino (PBS) (sem EDTA) e filtro de esterilizar. Prepar…

Discussion

Nós usamos ratos Sprague Dawley de nossas culturas.

Tire um tempo e cuidado ao limpar os gânglios. Remover todos os detritos, vasos sangüíneos e gordura. Este passo é importante para garantir uma cultura que é mais ou menos homogêneo e livre de tipos de células estranhas. A adição de uridine/5-FDU em grande parte eliminar qualquer resquício de células não-neuronais (mitose) contaminando a cultura ou, pelo menos, reprimir a sua proliferação.

Além disso, durante a etapa de dissociação, ser paciente e ter temp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NZ gostaria de agradecer aos membros do laboratório Subhas Biswas, Andrew Sproul, e Ryan Willet para a formação dela em dissecar e colheita neurônios simpáticos. Suportada por concessões do NIH-NINDS.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Forceps, Stainless steel #5 Tool Roboz RS4976  
Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 Tool Roboz RS6760  
RPMI 1640 w/ L-Glutamin Reagent Cellgro, Mediatech, Inc. 10-040-CV  
Fetal Bovine Serum Reagent SAFC Biosciences 12103c  
Donor Horse Serum Reagent JRH Biosciences 12449 Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes.
Penicillin/streptomycin Reagent Gibco, Invitrogen 15140-122  
Trypsin without EDTA Reagent Difco MT 25-050-CI  
Uridine Reagent Sigma U3003  
5-Fluoro-5′ deoxyuridine Reagent Sigma F-8791  
NGF Reagent Harlan Bioproduct BT-5025  
Dissection Microscope and light source Microscope      
15 ml polypropylene tubes Tool BD Falcon 352096  
Cell culture dishes Tool Corning, Nunclone    

References

  1. Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
  2. Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
  3. Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
  4. Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
  5. Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
  6. Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
  7. Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
  8. Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).

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Cite This Article
Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988, doi:10.3791/988 (2009).

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