Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)
Summary
Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.
Abstract
Os gânglios cervical superior (GCS) de ratos são pequenos, brilhantes, em forma de amêndoa estruturas que contêm neurônios simpáticos. Esses neurônios fornecem inervação simpática para a cabeça e pescoço e constituem uma população bem caracterizados e relativamente homogêneo (4). Neurônios simpáticos são dependentes de fator de crescimento neural (NGF) para a diferenciação, sobrevivência e crescimento axonal ea propagação de grande disponibilidade de NGF facilita sua cultura e manipulação experimental (2, 3, 6). Por estas razões, cultivadas neurônios simpáticos têm sido utilizadas em uma ampla variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento neuronal e diferenciação, os mecanismos de morte celular programada e patológicos, e transdução de sinal (1, 2, 5 e 6). Dissecando o SCG de ratos recém-nascidos e neurônios simpáticos cultura não é muito complicado e pode ser dominada com bastante rapidez. Neste artigo, iremos descrever em detalhes como dissecar o SCG de filhotes de rato recém-nascido e para usá-los para estabelecer culturas de neurônios simpáticos. O artigo também descreve as etapas preparatórias e os vários reagentes e equipamentos que são necessários para alcançar este objectivo.
Protocol
Discussion
Nós usamos ratos Sprague Dawley de nossas culturas.
Tire um tempo e cuidado ao limpar os gânglios. Remover todos os detritos, vasos sangüíneos e gordura. Este passo é importante para garantir uma cultura que é mais ou menos homogêneo e livre de tipos de células estranhas. A adição de uridine/5-FDU em grande parte eliminar qualquer resquício de células não-neuronais (mitose) contaminando a cultura ou, pelo menos, reprimir a sua proliferação.
Além disso, durante a etapa de dissociação, ser paciente e ter temp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ gostaria de agradecer aos membros do laboratório Subhas Biswas, Andrew Sproul, e Ryan Willet para a formação dela em dissecar e colheita neurônios simpáticos. Suportada por concessões do NIH-NINDS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
References
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
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- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
