Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)
Summary
Dit is een protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur primaire sympathische neuronen van een superieure cervicale ganglia (SCG) van pasgeboren ratten pups.
Abstract
De superieure cervicale ganglia (SCG) bij ratten zijn kleine, glanzende, amandel-vormige structuren die sympathische neuronen bevatten. Deze neuronen zorgen sympathiek innervaties voor het hoofd en de nek regio en vormen zij een goed gekarakteriseerd en relatief homogene populatie (4). Sympathische neuronen zijn afhankelijk van zenuw groeifactor (NGF) om te overleven, differentiatie en axonale groei en de wijdverbreide beschikbaarheid van de NGF vergemakkelijkt hun cultuur en experimentele manipulatie (2, 3, 6). Om deze redenen hebben gekweekte sympathische neuronen is gebruikt in een breed scala van studies met inbegrip van neuronale ontwikkeling en differentiatie, mechanismen van geprogrammeerde celdood en pathologische, en signaaltransductie (1, 2, 5 en 6). Ontleden van de SCG van pasgeboren ratten en het kweken van sympathische neuronen is niet erg ingewikkeld en kan vrij snel onder de knie. In dit artikel zullen we in detail beschrijven hoe te ontleden het SCG van pasgeboren ratten pups en om ze te gebruiken om culturen van sympathische neuronen vast te stellen. Het artikel zal beschrijven ook de voorbereidende stappen en de verschillende reagentia en apparatuur die nodig zijn om dit te bereiken.
Protocol
Discussion
We maken gebruik van Sprague Dawley ratten voor onze culturen.
Neem de tijd en zorg bij het schoonmaken van de ganglia. Verwijder alle vuil, bloedvaten en vet. Deze stap is belangrijk te zorgen voor een cultuur die is min of meer homogeen en vrij van vreemde celtypen. De toevoeging van uridine/5-FDU zal grotendeels te elimineren alle resterende niet-neuronale (mitotische) cellen besmetten van de cultuur of in ieder geval onderdrukken hun proliferatie.
Daarnaast, tijdens de dissociatie stap, wees geduldig en neem de tijd om d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ wil lab leden Subhas Biswas, Andrew Sproul, en Ryan Willet bedanken voor de opleiding van haar in te ontleden en te oogsten sympathische neuronen. Ondersteund door subsidies van de NIH-NINDS.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
References
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
