Summary

Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)

Published: January 30, 2009
doi:

Summary

Dit is een protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur primaire sympathische neuronen van een superieure cervicale ganglia (SCG) van pasgeboren ratten pups.

Abstract

De superieure cervicale ganglia (SCG) bij ratten zijn kleine, glanzende, amandel-vormige structuren die sympathische neuronen bevatten. Deze neuronen zorgen sympathiek innervaties voor het hoofd en de nek regio en vormen zij een goed gekarakteriseerd en relatief homogene populatie (4). Sympathische neuronen zijn afhankelijk van zenuw groeifactor (NGF) om te overleven, differentiatie en axonale groei en de wijdverbreide beschikbaarheid van de NGF vergemakkelijkt hun cultuur en experimentele manipulatie (2, 3, 6). Om deze redenen hebben gekweekte sympathische neuronen is gebruikt in een breed scala van studies met inbegrip van neuronale ontwikkeling en differentiatie, mechanismen van geprogrammeerde celdood en pathologische, en signaaltransductie (1, 2, 5 en 6). Ontleden van de SCG van pasgeboren ratten en het kweken van sympathische neuronen is niet erg ingewikkeld en kan vrij snel onder de knie. In dit artikel zullen we in detail beschrijven hoe te ontleden het SCG van pasgeboren ratten pups en om ze te gebruiken om culturen van sympathische neuronen vast te stellen. Het artikel zal beschrijven ook de voorbereidende stappen en de verschillende reagentia en apparatuur die nodig zijn om dit te bereiken.

Protocol

1. Voorbereiding voor de dissectie: Selecteer de juiste cultuur schotel (10 cm of 6-well of 24-well platen, enz.), afhankelijk van de aard van uw experimenten, en smeer ze met een rat-tail collageen 24 uur voor dissectie. De methoden voor het bereiden van rat-tail collageen en dat te gebruiken vacht cultuur gerechten zijn elders beschreven (1). Bereid een 0,25% trypsine oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (geen EDTA) en filter steriliseren. Voor te bereiden 1 ml porties en bewaar bij …

Discussion

We maken gebruik van Sprague Dawley ratten voor onze culturen.

Neem de tijd en zorg bij het schoonmaken van de ganglia. Verwijder alle vuil, bloedvaten en vet. Deze stap is belangrijk te zorgen voor een cultuur die is min of meer homogeen en vrij van vreemde celtypen. De toevoeging van uridine/5-FDU zal grotendeels te elimineren alle resterende niet-neuronale (mitotische) cellen besmetten van de cultuur of in ieder geval onderdrukken hun proliferatie.

Daarnaast, tijdens de dissociatie stap, wees geduldig en neem de tijd om d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NZ wil lab leden Subhas Biswas, Andrew Sproul, en Ryan Willet bedanken voor de opleiding van haar in te ontleden en te oogsten sympathische neuronen. Ondersteund door subsidies van de NIH-NINDS.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Forceps, Stainless steel #5 Tool Roboz RS4976  
Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 Tool Roboz RS6760  
RPMI 1640 w/ L-Glutamin Reagent Cellgro, Mediatech, Inc. 10-040-CV  
Fetal Bovine Serum Reagent SAFC Biosciences 12103c  
Donor Horse Serum Reagent JRH Biosciences 12449 Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes.
Penicillin/streptomycin Reagent Gibco, Invitrogen 15140-122  
Trypsin without EDTA Reagent Difco MT 25-050-CI  
Uridine Reagent Sigma U3003  
5-Fluoro-5′ deoxyuridine Reagent Sigma F-8791  
NGF Reagent Harlan Bioproduct BT-5025  
Dissection Microscope and light source Microscope      
15 ml polypropylene tubes Tool BD Falcon 352096  
Cell culture dishes Tool Corning, Nunclone    

References

  1. Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
  2. Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
  3. Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
  4. Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
  5. Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
  6. Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
  7. Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
  8. Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).

Play Video

Cite This Article
Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988, doi:10.3791/988 (2009).

View Video