Summary
Bu, yeni doğmuş sıçan yavruların üstün servikal ganglion (SCG) birincil sempatik nöronlar izole ve kültür nasıl açıklayan bir protokoldür.
Abstract
Sıçanlarda üstün servikal ganglion (SCG), sempatik nöronlar içeren küçük, parlak, badem biçimli yapılar. Bu nöronlar, baş ve boyun bölgeleri için sempatik innervations sağlamak ve iyi karakterize ve görece homojen bir nüfus (4) oluşturmaktadır. Sempatik nöronlar NGF, kullanılabilirlik, kendi kültür ve deneysel manipülasyon (2, 3, 6) kolaylaştırır, hayatta kalma, farklılaşma ve aksonal büyüme ve yaygın sinir büyüme faktörü (NGF) bağlıdır. Bu nedenlerden dolayı, kültürlü, sempatik nöronlar nöronal gelişim ve farklılaşma, ve patolojik programlanmış hücre ölümü mekanizmaları ve sinyal iletimi (1, 2, 5 ve 6) da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede çalışmalar kullanılmaktadır. Yeni doğan sıçan ve kültür sempatik nöronlar SCG Diseksiyon çok karmaşık değildir ve oldukça hızlı bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, yeni doğan sıçan yavrular SCG incelemek ve sempatik nöronların kültürleri kurmak için bunları kullanmak için ne kadar detaylı bir şekilde anlatacağız. Makalede ayrıca, hazırlık adımları ve bunu başarmak için gerekli olan çeşitli reaktifler ve ekipman anlatacağız.
Protocol
1. Diseksiyon için hazırlanması:
- Uygun kültür deneyler doğa bağlı olarak çanak (10 cm veya 6-iyi ya da 24 kuyu tabak, vb), ve sıçan kuyruklu kollajen 24 saat diseksiyonu önce ceket seçin. Sıçan kuyruğu kollajen hazırlanması ve kat kültür yemekleri kullanarak yöntemleri (1) başka bir yerde tarif edilmiştir.
- % 0.25 tripsin çözüm hazırlayın fosfat tamponlu salin (PBS) (hiçbir EDTA) ve sterilize. -20 º C'de 1 ml alikotları ve mağaza hazırlayın
- Distile / deiyonize H 2 O. üridin, 2.5 mM ve 5-FDU içeren bir çözüm hazırlayın Filtre sterilize ve 50 ul alikotları hazırlamak. -20 º C'de muhafaza
- % 10 ısı inaktive at serumu (ısı 56 º C su banyosunda 30 dakika inkübe edilmesiyle inaktive) ve% 5 fetal sığır serumu: Komple Orta RPMI 1640 kültür ortamı hazırlayın.
- Final Orta hazırlayın:% 1 ısı inaktive at serumu + NGF (100ηg/ml son konsantrasyon) + penisilin / streptomisin (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU çözüm RPMI 1640 kültür ortamı (10 mcM final konsantrasyon) . Not: her zaman kullanmadan önce bu ortamda taze yapılmalıdır. 24 plaka formatında bir deney için, bir 12 ml Bu orta hazırlamanız gerekir. Bu küçük bir ekstra hazırlar tavsiye edilir. NGF (Bu protokol sonunda Tablo) çeşitli ticari kaynaklardan satın alınabilir.
- Ekipman: Tek bir diseksiyon mikroskobu ve ışık kaynağına ihtiyacınız olacaktır. Odaklanarak ipuçları ile ikili Gooseneck fiber optik aydınlatma tercih edilmektedir. Iki çift, paslanmaz çelik forseps mikro diseksiyon diseksiyon makas (paslanmaz çelik bir çift: Buna ek olarak, bir (otoklavlayarak ya da en az 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde sırılsıklam) aşağıdaki diseksiyon araçlarını temizlemek ve sterilize etmek için ihtiyacınız olacak ve Roboz her ikisi de). İki steril enjektör iğneleri (26 gague x 1 ½ inç veya benzeri) da ihtiyaç duyulacaktır. Bu bir diseksiyon tahtası, alüminyum folyo ile sarılır ve bir Kimwipe kaplı strafor 3 "x3" parça kurmak için gereklidir. Dekontamine% 70 etanol ile yönetim kurulu püskürtün. Son olarak, bir yangın parlatılmış cam mera pipet hazırlar. Yangın cilası için dönerken, cam pipet ve bir kaç saniye için alev ucu tutun. Inceleme üzerine, ucu pürüzsüz bir görünüm ve açılış dar olacaktır. Bu hücreler ayrılamaz adım için gerekli. Pipet steril kalması için bir hücre kültürü kaputu yangın parlatma gerçekleştirin.
2. Üstün Servikal Ganglia Diseksiyon:
- Yaş P0 ve P1 yenidoğan sıçan yavrularının toplayın.
- Hızla kontaminasyon olasılığını azaltmak için% 70 etanol ile diseksiyon için yavru silin.
- Hızla keskin bir makas çifti (bu adımı video gösterilmeyecektir) yavru başını kesmek. Kısaca aşırı kan akıtmak için steril gazlı bez karşı steril forseps kullanarak kafa tutun.
- Ventral tarafı yukarı bakacak ve yönelmiştir kuyruk ucu ile diseksiyon pad üzerinde kafa yerleştirin. Kopmuş trakea kolayca görünür olmalıdır. Rağmen bir pin pad içine ağız çatı itme ve yastık içine kopmuş trakea rağmen ikinci pimi itin şu şekilde diseksiyon pad kopmuş başını sabitlemek için steril şırınga iğneleri kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında yastık yerleştirin ve diseksiyon başlayın.
- Hem forseps (her elindeki biri), trakea çevresinde temizlemek deri ve yağ kullanımı, bakımı çok derin değil. Bunu yapmak neredeyse trakeanın her iki tarafında birbirine paralel çalışan kasların bir çift gösterecektir. Not: Diseksiyon sırasında, soğuk steril PBS veya soğuk, steril, Pasteur pipeti ile teslim aşırı kan yıkayacak ve bölgenin temiz ve nemli tutmak için serum serbest RPMI 1640 orta ile sulamak gerekir. Buna bağlı olarak sadece bir veya birden fazla kez yapılabilir, ne kadar hızlı bir çalışır. Bir deneyim dissektör için, bir çift gangliyon incelemek için sadece 2-3 dakika sürer.
- Bir tarafta ilk kas kesip çıkarmak için forseps kullanın.
- Kas kaldırıldıktan sonra, karotis arteri görünür hale gelecektir. Genellikle, ışığın pembemsi ve kan içerir. Çevresinde görebilirsiniz diğer kan damarları daha açık renkli görünebilir ve bu nedenle karotis arteri hemen fark olmayabilir. Bu arter bir "Y" şeklinde bir şerit gibi göründüğünü trakea ve çatallanmasıdır yanında çalışır. Bu çatallanma önemli bir dönüm noktası olduğunu ve bulunduğu kez, SCG bulmak için nispeten kolay olacaktır.
- En kaudal sonunda arter Sever ve forseps (diğer ucu hala bağlı) ile hafifçe yukarı kaldırın. Bunu yaptığınızda, thr dokusu gevşek bifurkasyonunun noktada arter bağlı ve badem şekilli, parlak görünümlü küçük bir kitle var göreceksinizöncesi ve / veya post-ganglion bağlaçlar EAD gibi. Bu üstün servikal ganglion. Öte yandan ikinci bir çift forseps yavaşça soğuk, serum serbest RPMI 1640 orta içeren küçük bir kültür çanak (35 mm) ve yer ayırmak için kullanın.
- Daha sonra, aynı protokol Trakeanın diğer tarafta ganglion ayıklamak.
3. Ganglia Temizleme:
- Bir kez tüm ganglionlar disseke olmuştur, onlar mümkün olduğunca gereksiz doku serbest bırakılmalıdır.
- Diseksiyon mikroskobu altında, karotis arter, yağ veya diğer doku parçalarıyla ganglionlar bağlı olduğunu görebilirsiniz. Bu istenmeyen maddeleri uzaklaştırmak kızdırmak için her el forseps ile çalışın. Yeri RPMI 1640 orta içeren, steril bir 15ml konik, polipropilen tüp içine ganglionlar temizlenir.
- Öncesi ve / veya post-ganglion bağlaçlar da kesilmiş olmalı. Her ganglion yaklaşık 10.000 nöron vardır. Nöronlar kaplama sonra, onların neurites regrow.
4. Sempatik Nöron kültürü oluşturulması:
- 2 dakika boyunca 200xg ganglionlar Santrifüj ve supernatant atın.
- 0,5 - 1 ml% 0.25 tripsin çözüm ganglionlar tekrar 30 dakika için 37 ˚ C su banyosunda veya inkübatör yerleştirin. Bu ganglionlar hücreleri ayrıştırmaları yardımcı olacaktır.
- 30 dakika sonra, Komple Orta sulandırmak ve 2 dakika boyunca 200xg tripsin ve santrifüj nötralize etmek için 10 ml ekleyin.
- Final Orta 2 ml supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- Ayrıca yangın parlatılmış cam mera pipet ile ganglionlar yukarı ve aşağı triturating hücreleri ayrıştırmaları. Ganglionlar 20 kez Karışım ve birkaç dakika boyunca buz üzerinde tüp.
- Bu arada, (yaklaşık 2 / 3, 1 / 2 mm çapında) açılış dar yapmak için daha fazla yangın lehçe pipet. Soğuyuncaya kadar birkaç dakika bekleyin ve 20 kat daha fazla ganglionlar çiğnemek. Devam ederken, orta cloudier hücrelerin tedricen ayrışmış olduğunu bildiren olacak. Kez ya da iki kez daha hücrelerin ayrıştırmaları ne kadar iyi bağlı olarak bu adımı yineleyin. Bir süre sonra, tüm ganglionlarda nöron içine ayrı ve hiç bozulmamış ganglionlar tüp içinde görünür olduğunu fark edeceksiniz. Ayrıştırmaları değil bazı doku malzeme olabilir. Bu noktada, herhangi bir undissociated enkaz altına yerleşmek böylece tüp buz oturup birkaç dakika izin verin. Şimdi dikkatli bir şekilde neredeyse tüm orta ve üst yerden başka bir tüp içinde toplamak. Undissociated enkaz toplamak etmemelerini sağlamak için tüpün alt kısmında yaklaşık 50 ul bırakın. Final orta ayrışmış hücreleri içeren tüp ekle: bu birimde kültür plakasına bir kültür nöronlar kullanarak türüne bağlıdır. Örneğin: iyi ortalama Final orta 0.5 ml 24-iyi bir yemek, iyi ortalama istihdam edilecek ise, daha sonra plakası 0.5 ganglionlar (~ 10.000 nöronlar de ortalama). 24 ganglionlar verecekti 12 yavrular, tipik bir sıçan çöp oluşur. Bu tohum 24-plaka ve Final orta toplam hacmi 12 ml yeterlidir. Not: ganglionlar kültüründe mevcut olacaktır glia ve diğer hücre türleri küçük bir nüfus da içerir. Final ortamda Uridine/5-FDU kullanılması silahların yayılmasını önlemek ve ölüm teşvik edecektir.
- Yem hücreleri taze RPMI% 1 at serumu + NGF ve uridine/5-FDU ile 2 / 3 orta değiştirerek her 48 saatte bir. Not: İlk olarak, kültür, hiç neurites yuvarlak bir görünüm sempatik nöronlar içerir. Kısa neurites diseksiyonu 24 saat sonra görünür hale gelir ve kademeli olarak daha yoğun ve daha fazla zaman içinde dallı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz kültürlerin Sprague Dawley rat kullanın.
Ganglionlar temizlik zaman ve özen. Tüm artıkları, kan damarları ve yağ çıkarın. Bu adım, daha az ya da çok homojen ve gereksiz hücre tiplerinin bir kültür sağlanmasında önemlidir. Uridine/5-FDU eklenmesi, büyük ölçüde kültür kirlenmesine kalan (mitotik) non-nöronal hücrelerin ortadan kaldırılması ya da en azından onların çoğalmasını baskıladığı.
Buna ek olarak, ayrışma adım sırasında, sabırlı olun ve plakalar üzerine numaralı seribaşı sonra büyük yığınlarda bulunmayan böylece nöronlar ayırmak için zaman ayırın. Büyük hücre kümeleri olması iyi deneysel sonuçlar vermeyecektir. Örneğin, büyük öbekler zor nöronlar transfekte veya enfekte yapacaktır. Immün de engellenebilir ve nöronlar sayma gerektiren herhangi bir deney de yürütmek zor olacak.
Pen / strep kültürlerin beslenen her zaman orta tamamlamak için gerekli değildir. Hücrelerin kaplama kalem / strep ilk defa eklenmesi yeterlidir. Orta değiştirilir her zaman taze uridine/5-FDU orta eklerim.
NGF-çekilmesine tepki olarak apoptozis çalışmada sempatik nöronal kültürü var. Örneğin, Biswas ve ark. 2007 (2), sempatik nöronlar apoptozis desteklenmesinde önemli rol oynamaktadır çeşitli moleküllere karşı shRNA ile transfekte edildi. Deckwerth et al. 1996 (5), yabani-tip farelerden ve pro-apoptotik gen, Bax yoksun farelerden alınan sempatik nöronlar kullandık. Onlar bu nöronların NGF yoksun zaman nasıl davrandığını baktım. Şekil 6 Biswas ve arkadaşları. 2007 (2) Şekil 3 ve Deckwerth ark. 1996 (5) gösterisi transfekte ve non-transfekte sempatik nöronal kültürlerin sırasıyla gibi göründüğüne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NZ sempatik nöronlar diseksiyon ve hasat onu eğitim için laboratuar üyeleri Subhas Biswas, Andrew Sproul ve Ryan Willet teşekkür etmek istiyorum. NIH-NINDS gelen bağışlarla desteklenir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
