Summary
这是一个描述如何分离并培养颈上神经节（SCG）的新生幼鼠的主要交感神经元的协议。
Abstract
颈上神经节（SCG）在大鼠小，有光泽，杏仁状结构，其中包含交感神经元。这些神经元提供的头部和颈部区域的交感神经支配，它们构成了一个良好的特点和人口相对同质化（4）。交感神经元是依赖于神经生长因子（NGF）的存活，分化和轴突生长和广泛的传播，神经生长因子的空房情况，有利于他们的文化和实验操作（2，3，6）。基于这些原因，培养的交感神经元，已被用于各种各样的研究，包括神经元的发育和分化，编程和病理细胞死亡的机制和信号转导（1，2，5，6）。解剖SCG从新生大鼠和培养交感神经元是不是很复杂，可以掌握相当迅速。在这篇文章中，我们将详细描述了如何剖析，从新生幼鼠在SCG并使用它们来建立培养的交感神经元。文章还将介绍预备步骤和各种试剂和实现这一目标所需要的设备。
Protocol
1。解剖的筹备工作：
- 选择适当的培养皿（10厘米或6孔板或24孔板等）取决于您的实验性质，和大衣与鼠尾胶原24小时前清扫。准备鼠尾胶原蛋白，并用它来大衣培养皿的方法已在别处（1）。
- 准备0.25％胰蛋白酶溶液中的磷酸缓冲液（PBS）（无EDTA）和过滤消毒。准备1毫升分装和存储-20℃
- 准备一个解决方案包含在蒸馏水/去离子H 2 O 2.5毫米尿苷和5 - FDU过滤消毒，并准备50μL分装。贮存于-20℃
- 准备完全培养基：10％热灭活马血清（热灭活，在56 º C水浴孵育30分钟）和5％胎牛血清的RPMI 1640培养液。
- 准备最终中等：用1％热灭活马血清（100ηg/ml终浓度NGF）+青霉素/链霉素（1 / 250）+ 1 / 250 uridine/5-FDU解决方案的RPMI 1640培养基（终浓度为10μM） 。注意：这个媒介应新鲜，每次使用前。实验在24孔板格式，将需要准备12毫升这种媒介。建议你准备一点点额外的。 NGF可以从各种商业来源（见表）在本议定书年底购买。
- 设备：一是需要在解剖显微镜和光源。重点提示一个双鹅颈纤维光纤照明是首选。此外，将需要清洗和消毒（高压灭菌或用70％乙醇浸泡至少20分钟）以下的清扫工具：两对微解剖不锈钢镊子，和一双解剖剪刀（不锈钢从Roboz）。也需要两个无菌注射器的针头（26 gague × 1 ½英寸或类似）。有必要成立一个夹层板，这是一个3“X3”一块发泡胶包裹在铝箔和Kimwipe覆盖。喷雾用70％乙醇，以净化板。最后，准备一个火抛光的玻璃牧场吸管。以火抛光的玻璃吸管，并保持在几秒钟的火焰提示，同时旋转。检查后，提示会看起来更加平滑，开幕式将于窄。这是必要的步骤中，细胞将游离。细胞培养罩在执行消防抛光，使移液器保持无菌。
2。颈上神经节的剖析：
- 收集年龄P0或P1的新生幼鼠。
- 迅速用70％乙醇擦拭小狗解剖，以减少污染的机会。
- 快速斩首小狗一个锋利的剪刀（这一步不会显示在视频）。使用无菌钳对无菌纱布简单地漏多余的血液保持头部。
- 放在头部与腹朝上，尾结束向你面向的夹层垫。割断气管，应随时可见。使用无菌注射器针头，确保头颅解剖垫以下列方式：推到垫口的屋顶虽然一针和第二针推虽然割断气管垫到。解剖显微镜下放置垫，并开始清扫。
- 利用两个钳（每手之一）清除皮肤和气管周围的脂肪，小心不要去太深。这样做会暴露一双运行几乎平行于对方的气管两侧的肌肉。注：在清扫过程中，您将需要与冷无菌PBS或冷，无血清RPMI 1640培养液，用消毒，巴斯德吸管交付洗去多余的血液，以保持该地区的清洁和湿润灌溉。这可能只是一次或一次以上取决于一部作品的速度有多快。对于一个经验剥离，它需要大约只有两到三分钟，剖析了对神经节。
- 使用镊子，剪切和删除一侧的肌肉。
- 一旦被删除的肌肉，颈动脉会变得可见。往往是光粉红色的，含有血液。它可能会出现轻于其他血管的颜色，您可能会看到在附近，由于这个原因，颈动脉可能不太明显了。这看起来像一个“Y”形带状沿着气管和分叉动脉运行。这分岔是一个重要的里程碑，一旦它的位置，它会比较容易找到在SCG。
- 在最尾端的最终割断动脉钳（另一端仍连接）稍微抬不起来。一旦你这样做，你会看到一个杏仁状，有光泽寻找组织小肿块是松散连接到动脉，只是在分叉点，THREAD像前和/或后神经节的连接词。这是颈上神经节。另一方面在使用的第二双钳轻轻分离并将其放置在一个小培养皿中包含冷，无血清RPMI 1640培养基（35毫米）。
- 下一步，提取物对气管的另一端节遵循相同的协议。
3。清洗神经节：
- 一旦所有的神经节已被剥离出来，他们应该被释放尽可能多的多余组织。
- 解剖显微镜下，您可能会看到，神经节连接件的颈内动脉，脂肪或其他组织。每手钳，工作梳理了这些不必要的材料。成无菌15毫升圆锥形，聚丙烯管清洗节，含RPMI 1640培养液。
- 前和/或后神经节连接词也应削去。每个神经节神经元约10000。一旦神经元是镀金的，他们会重新长出的突起。
4。建立交感神经的神经元文化：
- 神经节在200xg离心2分钟，弃上清。
- 重悬在0.5至1毫升0.25％胰蛋白酶溶液中的神经节。 37˚彗星水浴或培养箱中放置30分钟。这将有助于游离于神经节细胞。
- 30分钟后，添加10毫升的完全培养基，以淡化和消除胰蛋白酶和200xg离心2分钟。
- 弃上清，悬浮在2毫升决赛中等。
- 进一步游离于研制过程与火抛光的玻璃牧场吸管，向上和向下的神经节细胞。磨碎的神经节的20倍和管置于冰上几分钟。
- 同时，火抛光的吸管更使开放窄（直径约2 / 3至1 / 2毫米）。等待几分钟，直到它冷却和磨碎的神经节的20倍以上。当你继续，将成为中期逐步多云说明这些细胞正在分离。重复此步骤，一次或两次取决于如何细胞游离。一段时间后，你会发现所有的神经节成神经细胞分离，并没有完整的神经节是在管中可见。可能有一些组织的材料，不会游离。在这一点上，让管坐了几分钟的冰，因此，任何未解离的碎片可以解决的底部。现在仔细收集从另一管的顶部和地方，几乎所有的媒体。为了确保你不收集未解离的碎片，留在试管底部约50μL。添加更多的最终介质的试管中分离的细胞：本卷取决于文化板块之一是用培养的神经元的类型。例如：如果是被聘用的24孔的菜，然后板0.5神经节（〜10,000元以及神经元），每孔0.5毫升每口井的最终中等。一个典型的大鼠垃圾由12个幼崽，这将使24神经节。这是足够的种子一个24孔板和终审介质的总体积为12毫升。注：神经节还包含一个人口小神经胶质细胞和其他类型的细胞，将目前的文化。在最后的媒介使用Uridine/5-FDU防止其扩散，并促进其死亡。
- 饲料细胞每48小时2 / 3的介质更换新鲜的RPMI 1％马血清+ NGF和uridine/5-FDU。注意：首先，文化包含交感神经元，看起来没有突起的圆形。短突起成为解剖后可见24小时，并逐步成为密集，随着时间的推移支。
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Discussion
我们用我们的文化SD大鼠。
需要时间和护理，清洗时的神经节。取出所有碎片，血管和脂肪。在确保文化，是多还是少均匀，无多余的细胞类型，这一步很重要。 uridine/5-FDU此外，将在很大程度上消除污染的文化任何剩余的非神经细胞（有丝分裂），或至少抑制其增殖。
此外，在解离步骤，耐心，花时间来单独的神经元，使他们没有发现在大的团块，一旦被接种到板块。大团块细胞不会产生良好的实验结果。例如，大团块将难以转染或受感染的神经元。免疫染色，也可能会受到阻碍，和任何需要计数的神经细胞的实验，将很难开展，以及。
这是没有必要的补充笔/链球菌每个文化是美联储中期的。除了笔/链球菌细胞镀首次就足够了。做补充新鲜uridine/5-FDU介质交换的介质每。
我们用同情神经文化研究在NGF的撤军细胞凋亡。例如，在比斯瓦斯等。 2007年（2），交感神经元分别转染的shRNA对发挥重要作用，促进细胞凋亡的几个分子。 Deckwerth等人。 1996年（5）用于从野生型小鼠和小鼠缺乏的促凋亡基因，Bax的交感神经元。他们看着这些神经元的行为时，他们的NGF剥夺。图6比斯瓦斯等。 2007年（2）和图3 Deckwerth等。 1996年（5）显示转染和未转染的同情神经文化一样，看看分别。
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Acknowledgments
新西兰想感谢她的实验室成员Subhas比斯瓦斯，安德鲁Sproul，和瑞安威利特培训，在解剖和收获交感神经元。由NIH - NINDS赠款支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
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- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
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- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
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