Summary
これは、新生児ラットの仔の上頚神経節（SCG）からプライマリ交感神経ニューロンを分離して培養する方法を説明するプロトコルです。
Abstract
ラットの上頚神経節（SCG）は交感神経ニューロンが含まれている小さな、光沢のある、アーモンド形の構造です。これらのニューロンは、頭頸部領域の交感神経神経支配を提供し、彼らは十分に特徴付けと、比較的均質な集団（4）を構成する。交感神経ニューロンは、生存、分化および軸索成長のための神経成長因子（NGF）に依存しており、NGFの広範な可用性は、自分たちの文化と実験的操作を容易に（2、3、6）。これらの理由から、培養交感神経ニューロンは、ニューロンの発達と分化、プログラムおよび病理学的細胞死のメカニズム、及びシグナル伝達（1、2、5、および6）を含む研究のさまざまな分野で使用されている。新生児ラットと培養交感神経ニューロンからSCGを解剖することは非常に複雑ではありませんし、かなり迅速に習得することができます。この記事では、新生児ラットの仔からSCGを分析すると、交感神経ニューロンの文化を確立するためにそれらを使用する方法を詳細に説明します。資料も準備手順と、これを達成するために必要な様々な試薬と装置を説明します。
Protocol
1。解剖のための準備：
- 解剖する前に、実験の性質、およびラットテールコラーゲンでコーティングして24時間に応じて適切な培養皿を（10センチまたは6ウェルまたは24ウェルプレート、など）を選択します。ラットテールコラーゲンを調製し、コート培養皿にそれを使用するための方法は、（1）他の場所に記載されている。
- リン酸塩で0.25％トリプシン溶液を調製生理食塩水（PBS）（無EDTA）とフィルター滅菌はバッファ。 -20℃で1mlのアリコートとストアを準備する
- 蒸留/脱イオンH 2 O、2.5 mMのウリジンのそれぞれと5 - FDUを含む溶液を準備するろ過滅菌し、50μlのアリコートを準備。 -20℃で保存
- 10％の熱不活化ウマ血清（熱が30分、56 º Cの水浴中でインキュベートすることによって不活性化）及び5％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地：完全培地を準備します。
- 1％の熱不活化ウマ血清+ NGF（100ηg/ml最終濃度）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1 / 250）+ 250分の1 uridine/5-FDU溶液（10μMの最終濃度）を含むRPMI 1640培地：最終的なメディアを準備します。 。注：すべての時間を使用する前に、この培地を新鮮で構成する必要があります。 24ウェルプレートフォーマットでの実験では、一つはこの培地12 mlのを準備しておく必要があります。それはあなたが少し余分に準備することをお勧めします。 NGFは、商業的供給源の多様性（このプロトコールの最後にある表を参照）から購入することができます。
- 設備：一つは解剖顕微鏡と光源が必要になります。焦点のヒントとデュアルグースネック光ファイバー照明器が好ましい。ステンレス製のピンセットをマイクロは、解剖用の二つのペア、および解剖ハサミ（また、ステンレス鋼：加えて、一つは（オートクレーブまたは少なくとも20分間70％エタノールに浸漬することによって）、以下の解剖ツールを洗浄し、滅菌する必要があります。とRobozからの両方）。二つの滅菌注射針（26 gague × 1 ½インチまたは類似の）も必要になります。それは発泡スチロールの3"× 3"ピースアルミホイルに包んでキムワイプで覆われている解剖のボードを、設定する必要があります。除染する70％エタノールで基板にスプレーしてください。最後に、ファイアーポリッシュガラスの牧草地のピペットを準備。回転しながら火を研磨するためには、、ガラスピペットを取ると、数秒のための炎の先端を保持する。検査時に、先端は滑らかになりますし、開口部が狭くなります。これは、細胞が解離されるステップのために必要です。ピペットは、滅菌残るように細胞培養のフードで火災、研磨を行います。
2。上頚神経節の解剖：
- 年齢P0またはP1のものである新生児ラットの仔を収集する。
- 急速に汚染の可能性を減らすために70％エタノールで解剖のために子犬を拭いてください。
- 急速にハサミ（このステップは、ビデオには表示されません）と子犬斬る。簡潔に過剰な血液を排出するために滅菌ガーゼに対して滅菌ピンセットを用いて頭部を保持する。
- 上に向けて腹側を解剖パッドとを志向尾方端にヘッドを置きます。切断された気管は容易に見えるはずです。パッドへの口の屋根も一つのピンを押すとパッドに断絶された気管かかわらずつ目のピンを押す：次の方法で解剖パッドに切断された頭部を保護するために無菌の注射針を使用してください。解剖顕微鏡の下にパッドを配置し、解剖を始める。
- 、気管の周りに両方鉗子（それぞれの手で1つ）離れて明確な皮膚や脂肪を使用して余りに深く行かないことに注意しながら。これを行うと、気管の両側に互いにほぼ平行に走って筋肉のペアを公開します。注：解剖時に、あなたが冷滅菌PBSまたは冷たい、過剰な血液を洗い流すために、エリアを清潔にし、潤いを保つために、滅菌、パスツールピペットで提供される無血清RPMI 1640培地で灌漑する必要があります。これは、に応じて、一度だけまたは複数回行うことができますどのように速くは動いて。経験の解剖のために、それは神経節のペアを分析する唯一の約2〜3分かかります。
- 最初の側の筋肉を切断し、除去する鉗子を使用する。
- 筋肉が削除されると、頚動脈が見えるようになります。多くの場合、それは光ピンク色であり、血液が含まれています。それはあなたの近くに表示されることがありますし、この理由のために頸動脈がすぐに顕著でないかもしれないこと、他の血管よりも色が薄く表示されることがあります。この動脈は、"Y"字型のリボンのようなものに気管および分岐すると一緒に動作します。この分岐は重要なランドマークであり、一度それが格納されている、それは、SCGを見つけることは比較的容易になります。
- ほとんどの尾方端に動脈を切断し、鉗子（もう一方の端がまだアタッチされている）とわずかに持ち上げます。一度これを行うには、THR緩くちょうど分岐の時点で、動脈に付着している組織のアーモンド形、光沢のある見て小さな質量を持って表示されます。プレおよび/または後の神経節の接続詞EADのような。これは、上頸神経節です。優しく冷たい、無血清RPMI 1640培地を含む小規模な培養皿（35ミリ）で、それと場所を分離するために他の手で鉗子の2番目のペアを使用してください。
- 次に、同じプロトコルに続く気管の反対側に神経節を抽出する。
3。ガングリオンのクリーニング：
- 一度、すべての神経が出解剖されている、彼らは可能な限り余分な組織のを解放する必要があります。
- 解剖顕微鏡の下で、神経は頸動脈、脂肪や他の組織片が接続されていることが表示される場合があります。これらの不要物を離れていじめるために、それぞれの手で鉗子を操作します。場所は、RPMI 1640培地を含む、滅菌15ミリリットルコニカル、ポリプロピレン管に神経節を掃除した。
- プレおよび/または後の神経節の接続詞はまた離れてトリミングする必要があります。各神経節は約10,000のニューロンを持っています。神経細胞が播種されると、彼らは彼らの神経突起を再生するだろう。
4。交感神経ニューロンの文化の確立：
- 2分間200xgで神経を遠心し、上清を捨てる。
- 0.25％トリプシン溶液の0.5〜1 mlの神経を再懸濁します。 30分、37˚Cウォーターバスまたはインキュベーターに置きます。これは神経節に細胞を解離するのに役立ちます。
- 30分後、出希釈し、2分間200xgでトリプシンと遠心分離機を中和するために完全培地10 mlを加える。
- 上清を捨て、最終的な培地2mlに再懸濁します。
- さらにファイアーポリッシュガラスの牧草地のピペットで上下に神経を摩砕して細胞を解離する。神経を20回ひいて粉にすると数分間チューブを氷上に置きます。
- 一方、（直径約2 / 3 1 / 2〜mm）の開口部が狭いように、火研磨ピペットより。それが冷えるまで数分間待ってから、20倍以上の神経を砕いて粉にする。続行するように、培地は細胞が解離されていることを示す次第にcloudierになります。一度か二度以上の細胞が解離どの程度に応じてこの手順を繰り返します。いくつかの時間後、すべての神経節が神経細胞に解離があるとない無傷の神経はチューブで表示されていないことがわかります。解離しないいくつかの組織の材料があるかもしれません。この時点で、任意の非解離破片が底に沈降できるように、チューブを数分間氷中に放置。今慎重に別のチューブの上部と場所から、ほぼすべてのメディアのを収集する。あなたが解離していないゴミを収集しないことを保証するために、チューブの底に約50μlを残す。解離細胞を含むチューブに最終的な媒体の多くを追加：このボリュームは、培養プレートのいずれかの文化に神経細胞を使用しているのタイプによって異なります。たとえば、次のように、ウェル当たりの最終培地0.5 mlで、ウェルあたり24ウェルディッシュに採用される場合には、プレート0.5節（ウェルあたり〜10,000ニューロン）。典型的なネズミの糞には、24節を与えるだろう12匹、で構成されています。これは、種子1つの24ウェルプレートおよび最終的なメディアの総容量は12 mlのに十分です。注：Gangliaはまたグリアと文化に存在すると、他の細胞型の小集団が含まれています。最終的な培地でUridine/5-FDUを使用しても、その増殖を防止し、彼らの死を推進していきます。
- 新鮮RPMI 1パーセントウマ血清+ NGFとuridine/5-FDUと培地の2 / 3を置き換えることにより、フィードセル毎に48時間。注：最初は、文化がない神経突起が付いている円形に見える交感神経ニューロンが含まれています。短い神経突起は、解剖後に表示されてから24時間となり、徐々に時間をかけて密度の高いとより多くの枝状になる。
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Discussion
私たちは文化のためのSprague Dawleyラットを使用。
神経節を清掃時間と世話をする。すべての残骸、血管や脂肪を取り除きます。このステップでは、多かれ少なかれ均質と無関係な細胞型のない文化を確保するために重要です。 uridine/5-FDUの加算は、主として文化を汚染する、残りの（有糸分裂）非神経細胞を排除するか、少なくともそれらの増殖を抑制します。
さらに、解離工程の間、患者になると、それらが大きな塊で発見されないようにそれらがプレート上に播種されると神経細胞を分離するために時間がかかる。細胞の大きな塊を持つことは、良い実験結果が得られません。例えば、大きな塊は、それが困難な神経細胞がトランスフェクションまたは感染するために行います。免疫染色はまた、障害となる可能性がありますし、神経細胞を数える必要とするすべての実験でも同様に、行うことが困難になります。
それは、ペン/連鎖球菌と文化が供給されるたびに、培地を補足する必要はありません。細胞が播種されているペン/連鎖球菌のほか初めてで十分です。培地に培地を交換するたびに新鮮なuridine/5-FDUを追加してください。
我々は、NGF -撤退に応答してアポトーシスを研究するために交感神経神経培養を使用している。たとえば、ビスワスでら。 2007（2）、交感神経ニューロンはアポトーシスを促進する上で重要な役割を果たすいくつかの分子に対してshRNAをトランスフェクションした。 Deckwerthら。 1996（5）アポトーシス促進遺伝子、バックスが欠如している野生型マウスとマウスから交感神経ニューロンを使用している。彼らはこれらのニューロンは、彼らはNGFが奪われるとどのように動作するかを見てきました。ビスワスらから図6。 2007（2）とDeckwerthらから図3。 1996年（5）ショートランスフェクションと非トランスフェクション交感神経ニューロン培養ではそれぞれ、どのようなものか。
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Acknowledgments
NZは交感神経ニューロンを解剖し、収穫の彼女を訓練するための研究室メンバーバースビスワス、アンドリュースプロウル、とライアンウィレットに感謝します。 NIH - NINDSからの補助金によって支え。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
