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Enumeração de algas via Metodologia Culturable
 
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Enumeração de algas via Metodologia Culturable

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz

As algas são um grupo altamente heterogêneo de microrganismos que têm um traço comum, a posse de pigmentos fotossintéticos. No meio ambiente, as algas podem causar problemas para os donos de piscinas, crescendo na água. As algas também podem causar problemas em águas superficiais, como lagos e reservatórios, devido às flores algas que liberam toxinas. Mais recentemente, as algas estão sendo avaliadas como novas fontes de energia através de biocombustíveis de algas. Algas verde-azulas são na verdade bactérias classificadas como cianobactérias. As cianobactérias não só fotossintthesizem, mas também têm a capacidade de fixar gás nitrogênio da atmosfera. Outras algas são eucarióticas, que vão desde organismos unicelulares até organismos multicelulares complexos, como algas marinhas. Estes incluem as algas verdes, os euglenóides, os dinoflagellates, as algas marrons douradas, diatomas, as algas marrons, e as algas vermelhas. Em solos, as populações de algas são frequentemente 106 por grama. Esses números são inferiores aos números correspondentes de bactérias, actinomycetes e fungos, principalmente porque a luz solar necessária para a fotossíntese não pode penetrar muito abaixo da superfície do solo.

Como as algas são fototróficas, obtendo energia da fotossíntese e carbono para biomassa de dióxido de carbono, elas podem ser cultivadas em meios de crescimento que consistem inteiramente em nutrientes inorgânicos e sem um substrato de carbono orgânico. A falta de substrato orgânico impede o crescimento de bactérias heterotróficas. Utilizando um meio de crescimento inorgânico, as algas originalmente presentes no solo ou na água podem ser quantificadas pelo método de número mais provável (MPN). O método MPN baseia-se em diluir sucessivamente uma amostra, de modo que as próprias algas sejam diluídas à extinção. A presença de algas em qualquer diluição é determinada por um sinal positivo de crescimento no meio, que é tipicamente um lodo verde de algas que resulta da fotossíntese. O uso de tubos de replicação em cada diluição e uma avaliação estatística do número de tubos positivos para o crescimento em qualquer diluição permite que o número de algas presentes na amostra original seja calculado. As tabelas mpn foram desenvolvidas e publicadas específicas para um determinado desenho de MPN, incluindo o número de réplicas utilizadas em cada diluição.

Procedure

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  1. Pese uma amostra de 10 g de solo que foi coletada úmida do campo, ou teve água adicionada a ele para que permaneça úmida por 2-3 dias. Note que o solo deve ser úmido, mas não saturado.
  2. Prepare uma série de diluição de 10 vezes adicionando os 10 g de solo em 95 mL de Solução modificada de Bristol(Figura 1). Para criar a Solução modificada de Bristol, dissolva o seguinte em 1.000 mL de água: 0,25 g NaNO3, 0,025 g CaCl2, 0,075 g MgSO-4 · 7H2O, 0,075 g K2HPO4, 0,018 g KH2PO4, 0,025 g NaCl e 0,5 mg FeCl3.
  3. Continue a série de diluição com a adição de 1 mL de suspensão A a 9 mL da Solução de Bristol e diluições sequenciais adicionais.
  4. Inoculato 5 tubos de réplica cada um contendo 9 mL de Solução modificada de Bristol com 1 mL cada uma das diluições 10-2 a 10-6 (Tabela 1).
  5. Incubar os tubos tampados por até 4 semanas em uma área exposta à luz solar.
  6. Observe os tubos para o crescimento de algas uma vez a cada 7 dias. Tubos com crescimento de algas parecem verdes.

Figure 1
Figura 1. Como fazer uma série de diluição de 10 vezes.

Tubo Diluição
B 10-2
C 10-3
D 10-4
E 10-5
F 10-6

Mesa 1. Tubos e diluições.

Algas são organismos fotossintéticos que vivem em vários ambientes. Algas que habitam o solo podem ser cultivadas em laboratório, e sua concentração enumerada usando cálculos simples.

As algas são um grupo altamente heterogêneo de organismos que têm um traço comum, ou seja, a posse de pigmentos fotossintéticos, comumente clorofila. A grande maioria das algas são microscópicas, no entanto, a definição exata do grupo é controversa, e também inclui algas marinhas, que são tipicamente macroscópicas.

No ambiente, as algas podem causar problemas em águas superficiais, como lagos ou reservatórios, formando flores algas que esgotam os nutrientes da água, bloqueando a passagem da luz além da superfície da água e liberando toxinas. A capacidade de enumerar algas em amostras permite que os cientistas avaliem a saúde de um ecossistema e o risco potencial de crescimento excessivo de algas.

Populações de algas em solos ocorrem frequentemente em cerca de dez mil células por grama. Esses números são tipicamente inferiores às concentrações correspondentes de bactérias, fungos ou actinomictos, pois as algas requerem luz solar para fotossíntese, que não podem penetrar muito abaixo da superfície do solo.

Este vídeo ilustrará como cultivar algas do solo em laboratório, e como enumerar a concentração de algas na amostra inicial do solo.

As algas têm efeitos benéficos nos ecossistemas. Algas azul-esverdedas, ou cianobactérias, têm a capacidade de fixar gás nitrogênio da atmosfera, tornando-as úteis no aumento do nitrogênio do solo em ambientes semiáridos e também como uma ferramenta potencial para a produção de biocombustíveis.

Outras algas são eucarióticas, e variam de monocelulares únicos a organismos multicelulares complexos, como algas marinhas. Estes incluem algas verdes, euglenóides, dinoflagellates e diatomas, algas marrons e algas vermelhas.

As algas são fototróficas, obtendo energia da fotossíntese e carbono para biomassa de dióxido de carbono. Como resultado, eles podem ser cultivados em mídia composta inteiramente de nutrientes inorgânicos, sem um substrato de carbono orgânico adicionado. Essa falta de substrato orgânico impede o crescimento de bactérias heterotróficas, que dependem de carbono orgânico externo para o crescimento.

Para cultivar algas para enumeração, as amostras de solo são diluídas em série dez vezes a 10-6 g de solo por mL, e cultivadas em meios de crescimento. Várias réplicas são feitas para cada diluição. Eles são então incubados em uma área bem iluminada por até 4 semanas para permitir o crescimento de algas.

A presença de algas em qualquer diluição é determinada por um sinal positivo de crescimento no meio, que normalmente aparecerá como um lodo verde. Finalmente, são consultadas tabelas mpn desenvolvidas empiricamente projetadas para o crescimento de algas, permitindo que o usuário determine a concentração de algas original com base no crescimento das réplicas de diluição. O método MPN baseia-se na diluição serial de amostras de modo que as algas são diluídas à extinção, o que significa que, em alguma diluição, não se segue o crescimento de algas.

Agora que estamos familiarizados com os conceitos por trás do cultivo e enumeração de algas a partir de amostras, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.

Para começar o experimento, primeiro peso fora 10 gramas de solo úmido que foi coletado úmido do campo, ou foi reidratado e permaneceu úmido por 2 a 3 dias. O solo deve, mas não saturado.

Em seguida, prepare uma série de diluição dez vezes adicionando os 10 gramas de solo primeiro a 95 mL da solução modificada de Bristol, ou MBS. Rotule isso como suspensão A.

Depois de tremer vigorosamente, continue a série de diluição adicionando 1 mL de suspensão A a 9 mL de MBS em um tubo de ensaio. Continue esta série de diluição de dez vezes mais 4 vezes para dar diluições de até 10-6 g por mL.

Em seguida, inocular 5 tubos de réplica, cada um contendo 9 mL de MBS com 1 mL de cada uma das diluições 10-1 a 10-5. Isso resulta em 5 tubos de réplica para cada diluição de 10-2 a 10-6. Tampe os tubos livremente.

Finalmente, incubar os tubos por 4 semanas em uma área exposta à luz solar. Observe os tubos para o crescimento de algas uma vez a cada 7 dias. Tubos que exibem crescimento de algas aparecerão verdes.

O número mais provável, ou MPN, é um método matemático comumente usado para enumerar microrganismos cultivados a partir da diluição de um substrato inicial concentrado. Levando em conta os fatores de diluição das soluções, e o número de tubos que mostram sinais positivos de crescimento a cada diluição, o número mais provável de organismos por grama de amostra original do solo pode ser calculado utilizando uma tabela MPN e fórmula simples.

Para calcular o MPN, a maior diluição com maior número de tubos de replicação positiva é atribuída ao rótulo de p1, neste caso, as réplicas do tubo C. Em contraste, alguns dos tubos da D & E são negativos sem sinais de crescimento de algas.

O número de tubos nas próximas duas diluições maiores que mostram crescimento positivo são rotulados como p2 e p3. Aqui, p2 = D e p3 = E.

O valor para p1 pode ser encontrado olhando para baixo a primeira coluna na tabela MPN. O mesmo deve ser feito com a coluna p2. Por fim, o valor da p3, através do topo, é usado para cruzar os dois definidos por p1 e p2, para dar um valor do número mais provável de organismos por mL.

Em seguida, para calcular a concentração de organismos por grama na amostra original do solo, esse valor é dividido pela concentração do solo na diluição à qual p2 foi atribuído. A equação a seguir é usada para definir o número real de organismos por grama de solo.

A enumeração de algas e análises de MPN têm uma ampla gama de aplicações, algumas das quais são exploradas aqui.

Este método de cultivo de enumeração de algas pode ser usado em uma variedade de configurações. Pode ser aplicado a rios ou lagos para determinar os níveis de algas e avaliar os riscos de flores algas nocivas. Alternativamente, pode ser usado para avaliar a limpeza e a segurança das águas mais diretamente utilizadas pelos seres humanos, incluindo piscinas, bebedouros ou outras fontes de água potável. Idealmente, em amostras de água potável e piscinas, não há algas presentes.

A análise do MPN para enumeração também pode ser aplicada a outros microrganismos não algas. Por exemplo, a qualidade da água pode ser avaliada utilizando organismos indicadores como coliformes ou E. coli. Aqui, as amostras podem ser cultivadas com meios que contenham produtos químicos que são alterados para produzir cor ou fluorescência na presença dos organismos indicadores. Ao realizar múltiplas pequenas réplicas deste experimento em células individuais, com amostras diluídas para uma concentração conhecida, a razão de células positivas pode ser referenciada a uma tabela de MPN para o organismo indicador específico, e a concentração inicial nas amostras determinadas.

As algas também podem ser cultivadas para aplicações comerciais. Por exemplo, alguns tipos de biofertilizantes utilizam algas azul-esverdedas, que podem atuar como simmbiontos com plantas, auxiliando sua fixação e absorção de nitrogênio, o que é particularmente útil para ajudar o crescimento das culturas em áreas com solo pobre. Da mesma forma, as algas podem ser cultivadas para biocombustíveis, ou como fonte de alimentos ricos em nutrientes para a pecuária.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à cultura e enumeração de algas. Agora você deve entender como diluir amostras de solo para o crescimento de algas, como cultivar algas em laboratório e como enumerar a concentração de algas de suas amostras iniciais. Obrigado por assistir!

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Results

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A Figura 2 é um exemplo de resultados representativos.

p1 é escolhido para ser o número de tubos de replicação da maior diluição (menos concentrada no solo) que tem o maior número de tubos positivos. Aqui, as réplicas do tubo B não contam, pois as do tubo C são de uma diluição maior. Em contraste, o número de tubos do Tubo D que mostram um sinal positivo de crescimento é menor do que os do Tubo C. Então, p1 = 5.

p2 e p3 são escolhidos para ser o número de tubos nas próximas duas diluições maiores que mostram um sinal positivo de crescimento. Assim, p2 = 3 e p3 = 1.

O valor para p1 pode ser encontrado olhando para baixo a primeira coluna na Tabela 2. O mesmo é feito na coluna p2. Em seguida, o valor de p3 (através da parte superior) cruza os dois definidos pelos valores de p1 e p2. Neste exemplo, o valor é de 1,1 organismos por mL.

Divida esse valor pela concentração de solo na diluição a que você atribuiu p2. Neste exemplo, este é o Tubo D.

Equation 1

Assim, neste exemplo, havia 1,1 x 104 algas por g de solo. Este valor é bastante típico do número de algas encontradas no solo.

Figure 2
Figura 2. Resultado hipotético de um experimento de enumeração de algas. Tubos sombreados indicam a presença de algas. Tubos não sombreados representam a ausência de algas.

Número mais provável para valores indicados de p3
p1 p2 0 1 2 3 4 5
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
--
0.018
0.037
0.056
0.075
0.094
0.018
0.036
0.055
0.074
0.094
0.11
0.036
0.055
0.074
0.093
0.11
0.13
0.054
0.073
0.092
0.11
0.13
0.15
0.072
0.091
0.11
0.13
0.15
0.17
0.090
0.11
0.13
0.15
0.17
0.19
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
4
5
0.020
0.040
0.061
0.083
0.11
0.13
0.040
0.061
0.082
0.1
0.13
0.16
0.060
0.081
0.10
0.13
0.15
0.17
0.080
0.10
0.12
0.15
0.17
0.19
0.10
0.12
0.15
0.17
0.19
0.22
0.12
0.14
0.17
0.19
0.22
0.24
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
4
5
0.045
0.068
0.093
0.12
0.15
0.17
0.068
0.092
0.12
0.14
0.17
0.20
0.091
0.12
0.14
0.17
0.20
0.23
0.12
0.14
0.17
0.20
0.23
0.26
0.14
0.17
0.19
0.22
0.25
0.29
0.16
0.19
0.22
0.25
0.28
0.32
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
0.078
0.11
0.14
0.17
0.21
0.25
0.11
0.14
0.17
0.21
0.24
0.29
0.13
0.17
0.20
0.24
0.28
0.32
0.16
0.20
0.24
0.28
0.32
0.37
0.20
0.23
0.27
0.31
0.36
0.41
0.23
0.27
0.31
0.35
0.40
0.45
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
0.13
0.17
0.22

0.34
0.41
0.17
0.21
0.26
0.33
0.40
0.48
0.21
0.26
0.32
0.39
0.47
0.56
0.25
0.31
0.38
0.45
0.54
0.64
0.30
0.36
0.44
0.52
0.62
0.72
0.36
0.42
0.5
0.59
0.69
0.81
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
0.23
0.33
0.49
0.79
1.3
2.4
0.31
0.46
0.7
1.1
1.7
3.5
0.43
0.64
0.95
1.4
2.2
5.4
0.58
0.84
1.2
1.8
2.8
9.2
0.76
1.1
1.5
2.1
3.5
16
0.95
1.3
1.8
2.5
4.3
--

Mesa 2. Números mais prováveis para uso com o design experimental neste exercício.

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Applications and Summary

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A metodologia do MPN é útil, pois permite a estimativa de uma população funcional com base em uma atribuição relacionada ao processo. No exemplo, o processo funcional foi a fotossíntese empreendida por algas, o que permitiu o crescimento na ausência de carbono orgânico. Isso permitiu que as populações totais de algas no solo fossem enumeradas.

A MPN também é usada para estimar o número de um tipo específico de patógenos microbianos na água, como Salmonella,utilizando a resistência de Salmonella ao verde malachite.

Outra aplicação é a estimativa de fungos micorrizais inoculando diluições do solo em um hospedeiro de plantas e procurando a colonização das raízes pelos fungos.

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