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Organic Chemistry

Preparazione di cristalli per l'analisi mediante diffrazione dei raggi X

$Growing Crystals for X-ray Diffraction Analysis$

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Growing Crystals for X-ray Diffraction Analysis

2.1: Introduction to Catalysis

2.13: Performing 1D Thin Layer Chromatography

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08:00 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr. Jimmy Franco – Merrimack College

La cristallografia a raggi X è un metodo comunemente usato per determinare la disposizione spaziale degli atomi in un solido cristallino, che consente la determinazione della forma tridimensionale di una molecola o di un complesso. Determinare la struttura tridimensionale di un composto è di particolare importanza, poiché la struttura e la funzione di un composto sono intimamente correlate. Le informazioni sulla struttura di un composto vengono spesso utilizzate per spiegarne il comportamento o la reattività. Questa è una delle tecniche più utili per risolvere la struttura tridimensionale di un composto o complesso, e in alcuni casi può essere l’unico metodo praticabile per determinare la struttura. La crescita dei cristalli di qualità a raggi X è il componente chiave della cristallografia a raggi X. La dimensione e la qualità del cristallo dipendono spesso molto dalla composizione del composto esaminato dalla cristallografia a raggi X. Tipicamente i composti contenenti atomi più pesanti producono un modello di diffrazione maggiore, quindi richiedono cristalli più piccoli. Generalmente, i cristalli singoli con facce ben definite sono ottimali e, in genere, per i composti organici, i cristalli devono essere più grandi di quelli contenenti atomi pesanti. Senza cristalli vitali, la cristallografia a raggi X non è fattibile. Alcune molecole sono intrinsecamente più cristalline di altre, quindi la difficoltà di ottenere cristalli di qualità a raggi X può variare tra i composti. La crescita dei cristalli a raggi X è simile al processo di ricristallizzazione che viene comunemente usato per purificare i composti, ma con un’enfasi sulla produzione di cristalli di qualità superiore. Spesso, è possibile ottenere cristalli di qualità superiore consentendo al processo di cristallizzazione di procedere lentamente, il che può verificarsi nel corso del giorno o dei mesi.

Principles

Esistono diversi metodi per la coltivazione di cristalli a raggi X, come il riscaldamento e il raffreddamento, l’evaporazione e la diffusione del vapore, ognuno con i propri vantaggi e limiti. ¹ Qui descritto è uno dei metodi più utili per la coltivazione di cristalli di qualità a raggi X, diffusione liquido-liquido. ² Il successo della crescita dei cristalli a raggi X dipende dalla corretta scelta dei solventi. Il composto deve essere solubile in un solvente ma insolubile in un altro. La diffusione liquido-liquido comporta l’accurata stratificazione di un solvente a bassa densità sopra un solvente ad alta densità in un tubo sottile, come un tubo NMR. Il tasso di diffusione può influenzare notevolmente le dimensioni e la qualità dei cristalli: la rapida diffusione favorisce i cristalli più piccoli, mentre la diffusione lenta favorisce la crescita di cristalli più grandi e di qualità superiore. L’utilizzo di tubi sottili, come i tubi NMR, rallenta la diffusione dei solventi, creando così un ambiente che facilita la crescita di cristalli di qualità superiore. I solventi comunemente usati per lo strato inferiore, in cui il composto viene disciolto, sono cloruro di metilene o cloroformio. Il composto viene disciolto nel solvente meno denso, ma questo può rivelarsi problematico in quanto il solvente superiore può iniziare ad evaporare prima della formazione del cristallo. La condizione ottimale è quella di avere i composti disciolti nel solvente più denso. Lo strato superiore è l’anti-solvente o precipitante. Gli anti-solventi frequentemente usati sono esano, pentano, etere etilico o metanolo. Una volta che i due solventi sono stati accuratamente stratificati, vengono lasciati diffondersi lentamente l’uno nell’altro. Il composto diventa meno solubile nella soluzione binaria, facilitando la formazione di cristalli a raggi X.

Procedure

1. Preparazione del tubo di cristallo e del filtro

Posizionare un tubo NMR in un matraccio Erlenmeyer.
Preparare un filtro per pipette.
1. Costruire il filtro posizionando un pezzo di salvietta senza lanugine (1 in. per 1 in.) nella pipetta, quindi utilizzare un’asta per incuneare saldamente la salvietta nella parte del collo di bottiglia della pipetta (Figura 1).
2. Crea due filtri a pipetta per ogni tubo di cristallo necessario.

2. Aggiunta del campione al tubo di cristallo

Sciogliere il composto (tetrafenilporfirina, 10 mg) in 0,75 ml di solvente (diclorometano).
Con una pipetta, aggiungere delicatamente la miscela nella parte superiore del tubo, facendola passare attraverso il filtro.
1. Le particelle vengono filtrate per evitare la creazione di siti di nucleazione, che possono portare a piccoli cristalli multipli invece dei singoli cristalli più grandi desiderati.
Una volta che il campione è stato posto nel tubo di cristallo, molto lentamente e delicatamente, aggiungere l’anti-solvente (1,5 ml di metanolo) al tubo attraverso una nuova pipetta filtrante. Lasciare che l’anti-solvente si strati lentamente sulla soluzione aggiunta in precedenza (Figura 2). Non utilizzare una lampadina per spingere il solvente attraverso la pipetta, ma lasciare che il solvente scorra attraverso il filtro da solo.
1. Assicurarsi che il solvente di densità più elevata venga aggiunto prima al tubo di cristallo.
2. Controllare che i due solventi siano miscibili l’uno con l’altro. Questo viene fatto prima dell’aggiunta del solvente.
Sigillare il tubo con un tappo NMR.

3. Crescita dei cristalli

Senza causare la miscelazione dei due solventi, posizionare i tubi di cristallo in un armadio dove non saranno disturbati.
Il tempo di cristallizzazione varierà con ogni composto, in genere i tubi di cristallo dovrebbero essere lasciati indisturbati per una settimana.
Dopo una settimana, ispezionare i tubi per la crescita dei cristalli.
1. La crescita dei cristalli avviene tipicamente all’interfaccia dei due solventi.
2. Ispezionare visivamente i tubi per la prova della crescita dei cristalli. Fare attenzione a non facilitare la miscelazione dei solventi, nel caso in cui il composto richieda più tempo per la formazione dei cristalli.
3. Se sembra che si sia verificata la crescita dei cristalli, ispezionare ulteriormente i tubi utilizzando un microscopio.

4. Selezione dei cristalli

I cristalli di diffrazione a raggi X dovrebbero avere facce ben definite.
I cristalli che si sono raggruppati insieme dovrebbero essere evitati, se possibile.
Lasciare i cristalli nel tubo di cristallo fino al momento di raccogliere il cristallo, immediatamente prima di posizionare il cristallo sul diffrattometro.
1. Mantenere i cristalli nel tubo assicurerà che i cristalli rimangano solvatati. La de-solvatazione può causare la rottura dei cristalli e ostacolare la diffrazione del cristallo.

Figura 1. Immagine del filtro pipetta. Un piccolo pezzo di salvietta senza lanugine è stato saldamente incastrato al collo di bottiglia della pipetta. Le soluzioni vengono passate attraverso questi filtri a pipetta prima di essere introdotte nel tubo di cristallo.

Figura 2. Una volta che la soluzione contenente il composto mirato viene posizionata nel tubo di cristallo, l’anti-solvente viene lentamente stratificato sopra facendolo passare attraverso un nuovo filtro a pipetta.

Un singolo cristallo è necessario per la determinazione della sua struttura. La qualità del cristallo influenza pesantemente la qualità e l’accuratezza della determinazione strutturale.

Un singolo cristallo è un solido in cui la disposizione delle molecole si ripete in tutte e tre le dimensioni. La disposizione spaziale degli atomi all’interno del solido cristallino può essere determinata utilizzando la cristallografia a raggi X. In questa tecnica, un campione cristallino puro è avvolto da un fascio di raggi X. Il cristallo diffrange i raggi X in uno schema distintivo legato alla struttura dei cristalli e alla composizione molecolare. Se un cristallo si forma troppo rapidamente, le molecole possono essere disordinate, le impurità possono essere incorporate nel cristallo o due o più cristalli fusi possono formarsi invece di un singolo cristallo. Pertanto, sono necessari metodi specializzati con enfasi sulla crescita lenta per produrre cristalli di qualità sufficiente per la cristallografia a raggi X.

Questo video illustrerà le caratteristiche desiderate dei cristalli di qualità a raggi X, dimostrerà una procedura per coltivarli e introdurrà alcune applicazioni di questa tecnica in chimica.

Gli elettroni diffondono i raggi X emettendo un’onda sferica a raggi X quando vengono colpiti. Se gli atomi sono in una disposizione ordinata, l’interferenza costruttiva tra le onde produce un modello di diffrazione caratteristico su un rivelatore a raggi X. Il cristallo viene ruotato all’interno del raggio per raccogliere modelli di diffrazione da più angolazioni. Con sufficienti modelli di diffrazione, la struttura molecolare può essere derivata.

I cristalli di qualità a raggi X generalmente formano forme simmetriche e hanno facce lisce e che riflettono la luce. Se visti al microscopio polarizzatore, saranno trasparenti, ma la maggior parte dovrebbe diventare scura quando ruotata di 90°. Questo indica una struttura altamente ordinata. Per far crescere questi cristalli, viene spesso utilizzata la diffusione liquido-liquido. Questo impiega due solventi miscibili: un solvente a bassa densità, o precipitante, in cui il composto da ricristallizzare è insolubile; e un solvente ad alta densità in cui il composto è solubile. Tipicamente, il rapporto volumetrico tra precipitante e solvente è 2:1.

Il precipitante a bassa densità viene stratificato su una soluzione concentrata del composto nel solvente ad alta densità. Nel corso del tempo, il composto diventa meno solubile quando il precipitante si mescola con la soluzione. Un’interfaccia solvente più piccola si traduce in una velocità di diffusione più lenta, producendo così cristalli più grandi e più puri. Ora che hai compreso i principi della coltivazione di cristalli di qualità a raggi X, passiamo attraverso una procedura per coltivarli mediante diffusione liquido-liquido.

Per iniziare, ottenere l’attrezzatura necessaria trovata nel protocollo di testo. Acquisire un solvente per il composto e un precipitante meno denso.

Per preparare un filtro per pipette, posizionare un piccolo pezzo di Kimwipe nella parte superiore di una pipetta di vetro e premere delicatamente la carta sul fondo del corpo della pipetta usando un’asta o lo stelo di un’altra pipetta, facendo attenzione a non forare la carta. Preparare due filtri per pipette. Inserirne uno nel tubo NMR. Se necessario, fissare l’assemblaggio con un morsetto da laboratorio e un supporto ad anello. Sciogliere circa 10 mg del composto da ricristallizzare in 0,75 ml di solvente.

Ora, aggiungere con attenzione la soluzione campione nel filtro della pipetta. Fissare una lampadina sulla parte superiore e spremere lentamente per passare la soluzione nel tubo NMR per rimuovere le impurità solide. Non permettere alla lampadina di ri-espandersi mentre è attaccata, poiché l’aspirazione rimuoverà la carta da filtro.

Quindi, rimuovere il filtro pipetta utilizzato e posizionare il secondo filtro nel tubo NMR. Pipettare circa 1,5 mL di precipitante nel tubo. Lasciare che il solvente passi attraverso il filtro per gravità. D’ora in poi, fai attenzione a non disturbare il filtro durante eventuali manipolazioni. Una volta che tutto il precipitante è filtrato nel tubo, rimuovere il filtro e tappare il tubo. Mettilo in un armadietto o in un’altra posizione facilmente controllale dove non sarà agitato.

Dopo almeno un giorno, ispezionare i tubi per la crescita dei cristalli. Se non sono presenti cristalli o i cristalli sono molto piccoli, lasciare indisturbata la provetta del campione. Se i cristalli sono visibili, controllarne le dimensioni e la forma senza disturbare gli strati di solvente.

Se i cristalli sono grandi, ben definiti e non sono raggruppati insieme, ispezionare i cristalli al microscopio per verificare il loro potenziale di qualità a raggi X. Non rimuovere i cristalli dal tubo fino a quando il diffrattometro non è pronto per iniziare la scansione. Se le molecole di solvente sono incorporate nella struttura cristallina, lasciare asciugare il cristallo degraderà il cristallo. Utilizzando la cristallografia a raggi X, la struttura molecolare di questi cristalli rosso-porpora scuro è stata verificata essere tetrafenilporfirina.

La cristallografia a raggi X è uno strumento analitico essenziale in chimica e biochimica.

I metodi di ricristallizzazione includono riscaldamento e raffreddamento, diffusione liquido-liquido, diffusione del vapore ed evaporazione lenta. Nella lenta evaporazione di un singolo sistema a solvente, il composto viene sciolto in una piccola quantità di solvente e posto in un contenitore con un piccolo foro nel cappuccio. Quando il solvente evapora, la concentrazione aumenta fino a quando il composto inizia a cristallizzare.

La funzionalità delle proteine è spesso correlata alla loro struttura. Tuttavia, le proteine possono essere molto difficili da cristallizzare. Devono essere sviluppate tecniche specializzate per far crescere cristalli di proteine di qualità a raggi X. Qui, una goccia di soluzione proteica viene miscelata con una goccia di precipitante e questa miscela viene sigillata in una camera con precipitante puro. Quando il vapore di solvente si diffonde dalla goccia, la solubilità della proteina nella goccia diminuisce e la proteina cristallizza lentamente. Un’altra tecnica mescola la soluzione proteica e il precipitante sotto l’olio minerale. Utilizzando queste tecniche, una varietà di proteine può essere cristallizzata per l’analisi.

Nella diffrazione della polvere, ogni possibile orientamento spaziale è rappresentato nel campione contemporaneamente. La diffrazione delle polveri non è così informativa sulla struttura come la diffrazione a raggi X a cristallo singolo a causa della perdita di dati di struttura tridimensionale. Invece, la diffrazione della polvere eccelle nell’analisi di miscele di solidi cristallini e nella valutazione della cristallinità delle strutture amorfe.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE ai cristalli in crescita per la cristallografia a raggi X. Ora dovresti avere familiarità con le proprietà dei cristalli di qualità a raggi X, una procedura per coltivarli e alcune applicazioni di questa tecnica in chimica.

Grazie per l’attenzione!

Results

La tecnica di diffusione liquido-liquido è stata utilizzata per creare cristalli di qualità a raggi X di tetrafenilporfirina. Utilizzando il diclorometano come solvente e il metanolo come anti-solvente, i liquidi sono stati lasciati diffondersi lentamente nel corso di una settimana senza essere disturbati. Grandi cristalli viola-rossastri scuri ben definiti formati all’interfaccia dei due solventi (Figura 3). La crescita dei cristalli può essere osservata visivamente. I cristalli sono cresciuti con facce molto ben definite, che possono essere viste al microscopio.

Figura 3. Cristalli di qualità di diffrazione a raggi X di TPP. I cristalli che sono raggruppati insieme o che stanno crescendo l’uno dall’altro dovrebbero essere evitati. Grandi cristalli singoli con facce ben definite in genere producono risultati migliori.

Applications and Summary

I cristalli di qualità a raggi X possono essere coltivati mediante diffusione liquido-liquido. La lenta diffusione del sistema binario a solvente permette la creazione di cristalli adatti alla diffrazione a raggi X. Questo metodo consente al reticolo cristallino di formarsi lentamente, spesso portando a cristalli più grandi e ben definiti. L’uso di tubi NMR facilita la lenta diffusione dei solventi, consentendo una crescita ottimale dei cristalli. Questo processo può richiedere da pochi giorni a diversi mesi. Spesso durante il processo di cristallizzazione le molecole di solvente sono incorporate nel reticolo cristallino. Quindi è importante evitare di lasciare che i cristalli si “secchino”. Pertanto, uno dei vantaggi della diffusione liquido-liquido è che i cristalli crescono tipicamente all’interfaccia dei due solventi, il che aggira questo fenomeno.

La diffusione liquido-liquido è una delle tecniche più utili per la produzione di cristalli di qualità a raggi X, che è il componente più essenziale della cristallografia a raggi X. Ottenere cristalli di qualità a raggi X è in genere il fattore limitante nella conduzione di esperimenti di cristallografia a raggi X. La cristallografia a raggi X crea essenzialmente un’immagine tridimensionale della struttura di una molecola, rendendola il metodo meno ambiguo per determinare la configurazione completa di un composto. Poiché la struttura e la funzione delle molecole sono intimamente correlate, la capacità di decifrare la struttura tridimensionale di un composto è estremamente utile per una varietà di applicazioni chimiche e farmaceutiche. Ricercatori e aziende farmaceutiche utilizzano la cristallografia a raggi X per determinare la struttura delle proteine per esaminare come le piccole molecole interagiscono con gli enzimi ai fini della scoperta e della progettazione di farmaci. La cristallografia a raggi X ^3-5 è anche uno dei metodi più utili per valutare i complessi metallici. Questa tecnica divulga preziose informazioni su come i metalli interagiscono tra loro e con i suoi ligandi. Il primo legame quintuplo mai identificato tra due atomi di cromo è stato identificato utilizzando la cristallografia a raggi X. ⁶ Questa tecnica può essere utilizzata anche per spiegare le proprietà luminescenti dei complessi metallici. ⁷ La cristallografia è stata anche ampiamente utilizzata nella chimica ospite-ospite, poiché questo metodo è stato determinante nel rivelare preziose informazioni sulle interazioni non covalenti tra molecole. ⁸

References

Gilman, J. J., The art and science of growing crystals. Wiley: (1963).
Orvig, C., A simple method to perform a liquid diffusion crystallization. Journal of Chemical Education 62 (1), 84 (1985).
Brown, C. S.; Lee, M. S.; Leung, D. W.; Wang, T.; Xu, W.; Luthra, P. et. al. In silico derived small molecules bind the filovirus VP35 protein and inhibit its polymerase co-factor activity. Journal of molecular biology, 426 (10), 2045-2058 (2014)
Batt, S. M.; Jabeen, T.; Bhowruth, V.; Quill, L.; Lund, P. A.; Eggeling et. al. Structural basis of inhibition of Mycobacterium tuberculosis DprE1 by benzothiazinone inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,109 (28), 11354-9 (2012)
Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield et al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry 58 (14), 5599-5608 (2015)
Nguyen, T.; Sutton, A. D.; Brynda, M.; Fettinger, J. C.; Long, G. J.; Power, P. P., Synthesis of a Stable Compound with Fivefold Bonding Between Two Chromium(I) Centers. Science310 (5749), 844-847 (2005).
Chen, K.; Nenzel, M. M.; Brown, T. M.; Catalano, V. J., Luminescent Mechanochromism in a Gold(I)-Copper(I) N-Heterocyclic Carbene Complex. Inorganic Chemistry 54 (14), 6900-6909.(2015).
Franco, J. U.; Hammons, J. C.; Rios, D.; Olmstead, M. M., New Tetraazaannulene Hosts for Fullerenes. Inorganic Chemistry49 (11), 5120-5125 (2010).

Transcript

A single crystal is required for the determination of its structure. The quality of the crystal heavily influences the quality and accuracy of the structural determination.

A single crystal is a solid in which the molecule arrangement repeats in all three dimensions. The spatial arrangement of the atoms within the crystalline solid can be determined using X-ray crystallography. In this technique, a pure crystalline sample is enveloped by a beam of X-rays. The crystal diffracts the X-rays in a distinctive pattern related to the crystals structure and molecular composition. If a crystal is formed too quickly, the molecules may be disordered, impurities may be incorporated into the crystal, or two or more fused crystals may form instead of a single crystal. Therefore, specialized methods with emphasis on slow growth are needed to produce crystals of sufficient quality for X-ray crystallography.

This video will illustrate the desired characteristics of X-ray quality crystals, demonstrate a procedure for growing them, and introduce a few applications of this technique in chemistry.

Electrons scatter X-rays by emitting a spherical X-ray wave when hit. If the atoms are in an orderly arrangement, constructive interference between the waves produces a characteristic diffraction pattern on an X-ray detector. The crystal is rotated within the beam to collect diffraction patterns from multiple angles. With sufficient diffraction patterns, the molecular structure can be derived.

X-ray-quality crystals generally form symmetric shapes and have smooth, light-reflecting faces. When viewed under a polarizing microscope, they will be transparent, but most should become dark when rotated 90°. This indicates highly-ordered structure. To grow these crystals, liquid-liquid diffusion is often used. This employs two miscible solvents: a low-density solvent, or precipitant, in which the compound to be recrystallized is insoluble; and a high-density solvent in which the compound is soluble. Typically, the volumetric ratio of precipitant to solvent is 2:1.

The low-density precipitant is layered onto a concentrated solution of the compound in the high-density solvent. Over time, the compound becomes less soluble as the precipitant mixes with the solution. A smaller solvent interface results in a slower rate of diffusion, thus yielding larger, purer crystals. Now that you understand the principles of growing X-ray quality crystals, let’s go through a procedure for growing them by liquid-liquid diffusion.

To begin, obtain the necessary equipment found in the text protocol. Acquire a solvent for the compound and a less dense precipitant.

To prepare a pipette filter, place a small piece of Kimwipe into the top of a glass pipette and gently press the paper down to the bottom of the pipette body using a rod or the stem of another pipette, being careful not to puncture the paper. Prepare two pipette filters. Place one into the NMR tube. If necessary, secure the assembly with a laboratory clamp and ring stand. Dissolve about 10 mg of the compound to be recrystallized in 0.75 mL of solvent.

Now, carefully add the sample solution into the pipette filter. Affix a bulb to the top and slowly squeeze to pass the solution into the NMR tube to remove solid impurities. Do not allow the bulb to re-expand while it is attached, as the suction will dislodge the filter paper.

Next, remove the used pipette filter and place the second filter into the NMR tube. Pipette approximately 1.5 mL of precipitant into the tube. Allow the solvent to pass through the filter by gravity. From now on, take care not to disturb the filter during any manipulations. Once all of the precipitant has filtered into the tube, remove the filter and cap the tube. Place it in a cabinet or other easily checked location where it will not be agitated.

After at least one day, inspect the tubes for crystal growth. If no crystals are present or the crystals are very small, leave the sample tube undisturbed. If crystals are visible, check their size and shape without disturbing the solvent layers.

If the crystals are large, well-defined, and are not clustered together, inspect the crystals under a microscope to verify their potential to be X-ray quality. Do not remove the crystals from the tube until the diffractometer is ready to begin the scan. If solvent molecules are incorporated into the crystal structure, allowing the crystal to dry will degrade the crystal. Using X-ray crystallography, the molecular structure of these dark reddish-purple crystals was verified to be tetraphenylporphyrin.

X-ray crystallography is an essential analytical tool in chemistry and biochemistry.

Recrystallization methods include heating and cooling, liquid-liquid diffusion, vapor diffusion, and slow evaporation. In slow evaporation of a single solvent system, the compound is dissolved in a small amount of solvent and placed in a container with a small hole in the cap. As the solvent evaporates, the concentration increases until the compound begins crystallizing.

The functionality of proteins is often related to their structure. However, proteins can be very difficult to crystallize. Specialized techniques must be developed to grow X-ray-quality crystals of proteins. Here, a drop of protein solution is mixed with a drop of precipitant and this mixture is sealed in a chamber with pure precipitant. As the solvent vapor diffuses out of the drop, the solubility of the protein in the drop decreases, and the protein slowly crystallizes. Another technique mixes the protein solution and precipitant under mineral oil. Using these techniques, a variety of proteins can be crystallized for analysis.

In powder diffraction, each possible spatial orientation is represented in the sample simultaneously. Powder diffraction is not as informative about structure as single crystal X-ray diffraction because of the loss of three-dimensional structure data. Instead, powder diffraction excels in analyzing mixtures of crystalline solids and assessing the crystallinity of amorphous structures.

You’ve just watched JoVE’s introduction to growing crystals for X-ray crystallography. You should now be familiar with the properties of X-ray quality crystals, a procedure for growing them, and a few applications of this technique in chemistry.

Thanks for watching!

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