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X선 회절 분석을 위한 커지는 결정
 
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X선 회절 분석을 위한 커지는 결정

Overview

출처: 지미 프랑코 박사 연구소 - 메리맥 칼리지

X선 결정예학은 일반적으로 분자 또는 복합체의 3차원 형상의 측정을 허용하는 결정성 고체에서 원자의 공간 적 배열을 결정하는 데 사용되는 방법입니다. 화합물의 구조와 기능이 밀접하게 관련되어 있기 때문에 화합물의 3차원 구조를 결정하는 것은 특히 중요합니다. 화합물의 구조에 대 한 정보는 종종 그것의 행동 또는 반응성을 설명 하는 데 사용 됩니다. 이는 화합물 또는 복합체의 3차원 구조를 해결하는 데 가장 유용한 기술 중 하나이며, 경우에 따라 구조를 결정하는 유일한 실행 가능한 방법이 될 수 있다. 성장하는 X선 품질 결정은 X 선 결정학의 핵심 구성 요소입니다. 결정의 크기와 품질은 종종 X 선 결정학에 의해 검사되는 화합물의 조성에 크게 의존한다. 일반적으로 무거운 원자를 함유하는 화합물은 더 큰 회절 패턴을 생성하므로 더 작은 결정이 필요합니다. 일반적으로, 잘 정의된 면을 가진 단결정은 최적이며, 일반적으로 유기 화합물의 경우, 결정은 무거운 원자를 함유하는 결정보다 클 필요가 있다. 실행 가능한 결정없이, X 선 결정학은 가능하지 않습니다. 몇몇 분자는 그 외 보다는 본질적으로 더 결정적입니다, 따라서 엑스레이 질 결정을 얻기의 어려움은 화합물 사이에서 다를 수 있습니다. X 선 결정의 성장은 일반적으로 화합물을 정화하는 데 사용되지만 고품질 의 결정을 생산하는 데 중점을 둔 재결정화 과정과 유사합니다. 종종, 더 높은 품질의 결정은 결정화 과정이 천천히 진행되도록 함으로써 얻을 수 있으며, 이는 하루 또는 몇 달 동안 발생할 수 있습니다.

Principles

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난방 및 냉각, 증발 및 증기 확산과 같은 X 선 결정을 성장시키는 방법에는 여러 가지가 있으며, 각각 자체의 장점과 한계가 있습니다. 1 본명 에 기재된 X선 품질 결정, 액체 액체 확산을 성장시키는 가장 유용한 방법 중 하나입니다. 2 성공적인 X선 결정 성장은 용매의 적절한 선택에 따라 달라집니다. 화합물은 하나의 용매에서 용해되어야하지만 다른 용매에서 불용성해야합니다. 액체 액체 확산은 NMR 관과 같은 얇은 튜브의 고밀도 용매 위에 저밀도 용매를 조심스럽게 겹쳐두는 것을 포함합니다. 확산 속도는 결정의 크기와 품질에 크게 영향을 미칠 수 있습니다 - 빠른 확산은 더 작은 결정을 선호, 느린 확산은 크고 높은 품질의 결정의 성장을 선호하면서. NMR 튜브와 같은 얇은 튜브의 활용은 용매의 확산을 느리게하여 고품질 결정의 성장을 촉진하는 환경을 조성합니다. 화합물이 용해되는 하층용 용매는 메틸렌 염화물 또는 클로로폼이다. 화합물은 덜 조밀한 용매에 용해되지만, 상단 용매가 결정 형성 전에 증발하기 시작할 수 있기 때문에 문제가 있음을 증명할 수 있습니다. 최적의 조건은 화합물을 더 조밀한 용매에 용해시키는 것입니다. 상단 층은 용매 방지 또는 침전제입니다. 자주 사용되는 안티 용매는 헥산, 펜탄, 디틸 에테르 또는 메탄올입니다. 두 용매가 신중하게 계층화되면 천천히 서로 확산될 수 있습니다. 화합물은 이진 용액에서 덜 용해되어 X 선 결정의 형성을 용이하게합니다.

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Procedure

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1. 크리스탈 튜브 및 필터의 준비

  1. NMR 튜브를 에렌마이어 플라스크에 놓습니다.
  2. 파이펫 필터를 준비합니다.
    1. 파이펫에 보풀이 없는 와이프(1인치 by 1in.)를 배치하여 필터를 구성한 다음 막대를 사용하여 파이펫의 병목 현상 부분에 닦아 넣습니다(도1).
    2. 필요한 모든 크리스탈 튜브에 대해 두 개의 파이펫 필터를 만듭니다.

2. 크리스탈 튜브에 샘플 추가

  1. 용매 (디클로로메탄)의 0.75 mL에서 화합물 (테트라페닐포르피린, 10 mg)를 용해하십시오.
  2. 파이펫을 사용하여 필터를 통과하여 튜브 상단에 혼합물을 부드럽게 추가합니다.
    1. 입자는 핵 형성 부위의 생성을 피하기 위해 여과되어 원하는 큰 단일 결정 대신 작은 다중 결정으로 이어질 수 있습니다.
  3. 시료가 결정관에 매우 느리고 부드럽게 배치되면 새로운 필터 파이펫을 통해 튜브에 항용매 (메탄올 1.5 mL)를 추가하십시오. 용매 방지가 이전에 추가된 용액에 천천히 레이어되도록 허용합니다(그림 2). 전구를 사용하여 파이펫을 통해 용매를 밀어 내지 말고 용매가 필터를 통해 자체적으로 흐르도록 하십시오.
    1. 먼저 고밀도의 용매가 결정 튜브에 추가되는지 확인하십시오.
    2. 두 용매가 서로 잘못 처리되어 있는지 확인합니다. 이것은 용매를 첨가하기 전에 수행됩니다.
  4. NMR 캡으로 튜브를 밀봉합니다.

3. 크리스탈 성장

  1. 두 용매가 섞이는 원인이 되지 않고 크리스탈 튜브(들)를 캐비닛에 놓습니다.
  2. 결정화 시간은 각 화합물에 따라 달라집니다 - 일반적으로 결정 튜브는 일주일 동안 방해받지 않고 남아 있어야합니다.
  3. 일주일 후, 결정 성장을 위해 튜브를 검사합니다.
    1. 결정 성장은 전형적으로 두 용매의 인터페이스에서 발생합니다.
    2. 결정 성장의 증거를 위해 튜브를 육안으로 검사합니다. 용매의 혼합을 용이하게하지 않도록주의, 화합물이 결정 형성을위한 추가 시간이 필요한 경우.
    3. 결정 성장이 발생한 것으로 나타나면 현미경을 사용하여 튜브를 추가로 검사합니다.

4. 크리스탈 선택

  1. X선 회절 결정은 잘 정의된 면을 가져야 합니다.
  2. 가능하면 함께 클러스터된 크리스탈을 피해야 합니다.
  3. 크리스탈을 디락토미터에 놓기 직전에 크리스탈을 수확할 준비가 될 때까지 크리스탈 튜브에 놓습니다.
    1. 결정을 튜브에 보관하면 결정이 솔바게 유지됩니다. 해결 절제는 결정이 균열을 일으키고 결정의 회절을 방해할 수 있습니다.

Figure 1
그림 1. 파이펫 필터의 이미지입니다. 보풀이 없는 작은 와이프가 파이펫의 병목 현상에 단단히 쐐기를 박았다. 이 솔루션은 결정 튜브에 도입되기 전에 이러한 파이펫 필터를 통과합니다.

Figure 2
그림 2. 표적 화합물을 함유한 용액이 결정관에 배치되면, 항용매는 새로운 파이펫 필터를 통과하여 천천히 위에 겹쳐져 있습니다.

구조의 결정에 단일 결정이 필요합니다. 결정의 품질은 구조적 결단력의 품질과 정확성에 큰 영향을 미칩니다.

단일 결정은 분자 배열이 모든 3 차원에서 반복되는 고체입니다. 결정 체형 고체 내의 원자의 공간 배치는 X 선 결정학을 사용하여 결정될 수 있다. 이 기술에서 순수한 결정시 샘플은 X 선 빔으로 둘러싸여 있습니다. 결정은 결정 구조 및 분자 조성과 관련된 독특한 패턴으로 X 선을 확산시합니다. 결정이 너무 빨리 형성되면 분자가 무질서해질 수 있으며, 불순물이 결정으로 통합될 수 있거나, 또는 두 개 이상의 융합 결정이 단일 결정 대신 형성될 수 있다. 따라서 X선 결정촬영에 충분한 품질의 결정을 생성하기 위해서는 느린 성장에 중점을 둔 전문 방법이 필요합니다.

이 비디오는 X 선 품질 결정의 원하는 특성을 설명하고, 성장 절차를 시연하며, 화학 분야에서 이 기술의 몇 가지 응용 프로그램을 소개합니다.

전자는 명중 할 때 구형 X 선 파를 방출하여 X 선을 흩어. 원자가 질서 정연한 배열에 있는 경우, 파도 사이의 건설적인 간섭은 X 선 검출기에 특성 회절 패턴을 생성합니다. 결정은 여러 각도에서 회절 패턴을 수집하기 위해 빔 내에서 회전됩니다. 충분한 회절 패턴으로 분자 구조가 도출될 수 있습니다.

X선 품질의 결정은 일반적으로 대칭 모양을 형성하고 부드럽고 가벼운 반사 면을 가지고 있습니다. 편광 현미경으로 볼 때 투명하지만 대부분 90 °를 회전 할 때 어두워야합니다. 이는 고도로 정렬된 구조를 나타냅니다. 이러한 결정을 성장시키기 위해 액체 액체 확산이 자주 사용됩니다. 이것은 두 가지 잘못된 용매를 사용합니다: 재결정되는 화합물이 불용성인 저밀도 용매, 또는 침전제; 및 화합물이 용해되는 고밀도 용매. 전형적으로, 용매에 대한 침전제의 체피 비율은 2:1이다.

저밀도 침전제는 고밀도 용매에서 화합물의 농축 용액에 계층화된다. 시간이 지남에 따라, 강수제가 용액과 혼합될 때 화합물은 덜 용해됩니다. 용매 인터페이스가 작을수록 확산 속도가 느려지므로 더 크고 순수한 결정을 산출합니다. 이제 X선 품질의 결정 성장의 원리를 이해하게 되었으므로 액체 액체 확산으로 성장하는 절차를 살펴보겠습니다.

먼저 텍스트 프로토콜에 있는 필요한 장비를 가져옵니다. 화합물및 덜 조밀한 침전제를 위한 용매를 획득한다.

파이펫 필터를 준비하려면 작은 김스 와이프 조각을 유리 파이펫 의 상단에 놓고 용지를 막대 또는 다른 파이펫의 줄기를 사용하여 피펫 몸의 바닥으로 부드럽게 눌러 종이를 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 두 개의 파이펫 필터를 준비합니다. NMR 튜브에 하나를 놓습니다. 필요한 경우 실험실 클램프 및 링 스탠드로 어셈블리를 고정하십시오. 용매의 0.75 mL에서 재결정될 화합물의 약 10 mg을 용해.

이제 샘플 솔루션을 파이펫 필터에 조심스럽게 추가합니다. 전구를 상단에 부착하고 천천히 짜서 용액을 NMR 튜브에 전달하여 고체 불순물을 제거합니다. 흡입이 필터 용지를 제거하기 때문에 전구가 부착되는 동안 다시 팽창하는 것을 허용하지 마십시오.

다음으로, 사용된 파이펫 필터를 제거하고 두 번째 필터를 NMR 튜브에 배치합니다. 파이프약은 튜브내침전수량약 1.5mL입니다. 용매가 중력에 의해 필터를 통과 할 수 있습니다. 지금부터, 어떤 조작 하는 동안 필터를 방해 하지 않도록 주의. 모든 침전제가 튜브로 필터링되면 필터를 제거하고 튜브를 캡합니다. 캐비닛이나 쉽게 검사할 수 있는 위치에 놓습니다.

적어도 하루 후, 결정 성장을 위해 튜브를 검사합니다. 결정이 없거나 결정이 매우 작으면 샘플 튜브를 방해받지 않습니다. 결정이 보이는 경우 용매 층을 방해하지 않고 크기와 모양을 확인하십시오.

결정이 크고 잘 정의되고 함께 클러스터되지 않은 경우 현미경으로 결정을 검사하여 X 선 품질이 될 가능성을 확인합니다. 디락토미터가 스캔을 시작할 준비가 될 때까지 튜브에서 결정을 제거하지 마십시오. 용매 분자가 결정 구조에 통합되면 결정이 건조하도록 허용하면 결정이 저하됩니다. 엑스레이 결정법을 사용하여, 이 어두운 붉은 보라색 결정의 분자 구조는 테트라페닐포르피린으로 확인되었습니다.

X선 결정학은 화학 및 생화학에 필수적인 분석 도구입니다.

재결정화 방법에는 가열 및 냉각, 액체 액체 확산, 증기 확산 및 느린 증발이 포함됩니다. 단일 용매 시스템의 느린 증발에서 화합물은 소량의 용매에 용해되고 캡에 작은 구멍이있는 용기에 배치됩니다. 용매가 증발함에 따라 화합물이 결정화되기 시작할 때까지 농도가 증가합니다.

단백질의 기능은 종종 그들의 구조와 관련이 있습니다. 그러나 단백질은 결정화하기가 매우 어려울 수 있습니다. 단백질의 X 선 품질의 결정을 성장시키기 위해 특수 기술을 개발해야합니다. 여기서, 단백질 용액 한 방울은 강수량 한 방울과 혼합되며 이 혼합물은 순수한 침전제를 가진 챔버에서 밀봉된다. 용매 증기가 낙하에서 확산됨에 따라, 방울에 있는 단백질의 용해도가 감소하고, 단백질은 천천히 결정화됩니다. 또 다른 기술은 미네랄 오일 아래에 단백질 용액과 강수제를 혼합합니다. 이러한 기술을 사용하여 분석을 위해 다양한 단백질을 결정화할 수 있습니다.

분말 회절에서 가능한 각 공간 배향은 샘플에서 동시에 표시됩니다. 분말 회절은 3차원 구조 데이터의 손실로 인해 단일 결정 X 선 회절과 같은 구조에 대해 유익하지 않습니다. 대신, 분말 회절은 결정성 고체의 혼합물을 분석하고 비정질 구조의 결정성을 평가하는 데 탁월합니다.

X선 결정학을 위한 성장하는 결정에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 이제 X 선 품질 결정의 특성, 성장 절차 및 화학 분야에서이 기술의 몇 가지 응용 분야에 대해 잘 알고 있어야합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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액체 액체 확산 기술은 테트라페닐포르피린의 X선 품질 결정을 만드는 데 사용되었습니다. 디클로로메탄을 용매및 메탄올을 용매로 사용하여 액체는 방해받지 않고 일주일 동안 서서히 확산될 수 있었습니다. 두 용매의 계면에 형성된 크고 잘 정의된 어두운 보라색-붉은결정(도 3). 결정의 성장을 시각적으로 관찰 할 수 있습니다. 결정은 현미경으로 볼 수 있는 아주 잘 정의된 얼굴로 성장했습니다.

Figure 3
그림 3. TPP의 X선 회절 품질 결정. 함께 뭉치거나 서로 자라는 결정은 피해야 합니다. 잘 정의된 면을 가진 큰 단일 결정은 일반적으로 더 나은 결과를 산출합니다.

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Applications and Summary

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X선 품질의 결정은 액체 액체 확산에 의해 재배 될 수있다. 이진 용매 시스템의 느린 확산은 X 선 회절에 적합한 결정의 생성을 허용합니다. 이 방법을 사용하면 결정 격자가 천천히 형성되어 종종 더 크고 잘 정의된 결정으로 이어질 수 있습니다. NMR 튜브를 사용하면 용매의 느린 확산을 용이하게하여 최적의 결정 성장을 가능하게 합니다. 이 프로세스는 며칠에서 몇 달까지 어디서나 걸릴 수 있습니다. 종종 결정화 과정 동안 용매 분자는 결정 격자에 통합됩니다. 따라서 결정이 "건조"할 수 있도록 하는 것을 피하는 것이 중요합니다. 따라서, 액체 액체 확산의 장점 중 하나는 결정이 일반적으로 이 현상을 우회하는 두 용매의 인터페이스에서 성장한다는 것입니다.

액체 액체 확산은 X 선 결정학의 가장 필수적인 구성 요소인 X 선 품질 결정을 생산하는 데 가장 유용한 기술 중 하나입니다. X선 품질 결정을 얻는 것은 일반적으로 X 선 결정학 실험을 수행하는 데 한계 요인이됩니다. X선 결정예학은 본질적으로 분자 구조의 3차원 그림을 생성하여 화합물의 완전한 구성을 결정하는 가장 모호한 방법입니다. 분자의 구조와 기능은 밀접하게 관련되어 있기 때문에 화합물의 3차원 구조를 해독하는 능력은 다양한 화학 및 제약 응용 분야에 매우 유용합니다. 연구원과 제약 회사는 X 선 결정학을 사용하여 단백질의 구조를 결정하여 작은 분자가 약물 발견 및 설계를 위해 효소와 상호 작용하는 방법을 검사합니다. 3-5 X선 결정학은 또한 금속 복합체를 평가하기 위한 가장 유용한 방법 중 하나입니다. 이 기술은 금속이 서로 와 리간드와 상호 작용하는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 공개합니다. 두 크롬 원자 사이의 최초의 확인 된 다섯 쌍둥이 결합은 X 선 결정학을 사용하여 확인되었다. 6 이 기술은 또한 금속 복합체의 발광 특성을 설명하는 데 사용할 수 있습니다. 7 결정학은 또한 호스트 게스트 화학에서 널리 사용되어 왔으며,이 방법은 분자 간의 비 공유 상호 작용에 대한 귀중한 정보를 밝히는 데 중요한 역할을했습니다. 8

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References

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