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細菌のコロニーからコミュニティの DNA の抽出
 

細菌のコロニーからコミュニティの DNA の抽出

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細菌群集の DNA の抽出は、コミュニティ内で複数の菌種から DNA を得シングル抽出処理中にプロセスです。

土壌における微生物群集の伝統的な分析は通常文化試金、希釈を利用と異なる選択的メディア論をめっきを関与しています。しかし、多くの細菌は実験室の条件の下でまたは逃したまたは深刻な過小評価可能性がありますように選択すると、特定の成長メディア条件に不十分に成長します。

最近では、細菌の土壌サンプルから dna のコミュニティは細菌群集のより包括的なサンプリングの許可されています。この非文化に基づく伝統文化ベースの方法よりもより実際の社会の現在の代表と考えられています。

このビデオは、DNA の抽出の細菌群集の非培養法を実演します品質と抽出された DNA の量をチェックし、この DNA が細菌の多様性を研究に利用する方法を探索する方法。

土壌からの DNA の抽出は、2 つの方法のいずれかで実施できます。分別法で細胞はまず遺伝物質の抽出の前に土のマトリックスから区切られます。サンプルがゆっくりとブレンドの連続のサイクルにさらされて、そのまま細胞ペレットを収集するために遠心分離。

リゾチームは、細胞に添加し、懸濁液を培養します。リゾチームは、細菌の細胞壁を分解する酵素です。細胞壁構造が侵害された後、DNA が解放されて浄化のため。ただし、大きい DNA 濃度をもたらすコミュニティ DNA の抽出、その場でメソッドの 2 番目の方法を示されています。

ここでは、土壌の質量がトリス EDTA 抽出バッファーとガラス製のビーズの量と組み合わされて、土壌粒子からの細胞分離を容易にするために積極的に混合。洗剤が追加されます、一般的にサンプルや SDS、ドデシル硫酸ナトリウム、さらにブレンド細胞と DNA を含む彼らの内容のリリースの溶解を促進します。

任意の残りの細菌細胞を溶解する高温孵化をうけるし。サンプル、遠心分離、. ペレットに遠心し、DNA を沈殿させるために上澄みポリエチレング リコール抽出と培養を実行します。

DNA は TE バッファーで再停止されるし、さらに酢酸カリウムを洗うタンパク質や多糖類、DNA、これらの好ましくない成分をペレットに遠心分離を実施します。DNA を含む水溶液上澄みが削除され、さらにクリーンと DNA を集中するフェノール-クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿物を受けます。2 時間の部屋の温度の潜伏期間では、DNA は遠心分離、分析までストレージの TE バッファーで再停止されます。

今では私たちは概念と細菌群集の DNA の抽出の背後にあるプロセスに精通している、それは実験室で実施はどのように見てをみましょう。

手順を開始するには、ふるわれた土壌の 100 グラムを重量を量る。ポリプロピレン容器にこれを追加し、100 mL の Tris バッファーは土壌マトリックスからの細菌の放出を促進し、手で振る EDTA と改正から成る抽出バッファーを追加します。

次に、ガラス玉の 100 g の重量を量るし、混合容器にこれらを追加します。デバイスやメカアクション手首シェーカーを破ってビーズを使用して 5 分間サンプルを揺り動かしなさい。10 mL 20% ナトリウム dodecyl 硫酸塩、または SDS を混合物に追加し、追加分の扇動します。60 分の高温孵化させなさい。

同様に別の 50 mL チューブの中でサンプルを配布し、6,000 x g. で 10 分間遠心は単一の滅菌コンテナーにチューブから上澄みを転送します。次に、抽出バッファーの新鮮なボリュームを使用して、上記のとおり土壌ペレットに抽出を繰り返します。

次に、ボリュームも半分に満ちている 30% ポリエチレング リコールと 1.6 M 塩化ナトリウムの解決策クリーン 50 mL チューブに処理された上澄みの容量を追加します。ミックスするボトルの数回を手で反転し、DNA をペレットに 20 分間、10,000 × g で遠心分離機サンプル 2 のため室温で孵化させなさい。

部分精製核酸の餌を残して、遠心分離機管から上澄みを慎重に削除します。20 mL TE バッファーの渦、ペレットを再懸濁しますに 7.5 M カリウム酢酸溶液 1.5 mL を追加します。タンパク質と多糖類の沈殿物に 4 ° C で 30 分間 16,000 x g で 5 分遠心分離機氷の懸濁液を場所します。

次に、RNAse とプロテイナーゼ K をサンプルに追加する、手でやさしく混ぜて、しばらく放置します。抽出してミックスする懸濁液にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの量を追加そっと手で。遠心分離機 13,000 x g に 10 分のための準備は、遠心分離機、注 2 つのレイヤーから船を慎重に取り外します。

下、重い層フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールで構成されています、破片を抽出し、最上位のレイヤーは水性 DNA が含まれています。滅菌容器に水相を配置、イソプロパノールの相当量を追加して、DNA の沈殿物を開始する優しく反転します。30 分は上澄みを慎重に取り外しますと小球形にされた DNA 可能性がありますまたは可能性がありますいない容器の下部に表示される 1 mL の TE バッファーで、再懸濁しますの 16,000 × g で遠心分離によって常温 2 h. ペレット精製 DNA の懸濁液を孵化させなさい。

分光光度計または DNA ・ RNA 定量蛍光を使用して、サンプルから抽出した DNA のレベルを測定します。DNA ・ RNA fluorimeters ミリリットルあたりナノグラム単位で DNA レベルが出力されます。濃度が正確な測定値の高すぎる場合希釈懸濁液 10 を 1 または 100 に 1 分子レベルの水を使用します。

細菌群集から得られた DNA は、一度これはいくつかの異なる方法で利用できます。これらのアプリケーションのいくつかはここで検討されています。

写真コミュニティ DNA から抽出した DNA の解析は、指定された土壌サンプルで現在の細菌のセルの数への洞察力を提供できます。ソリューションの mL あたり ng の DNA の量は土壌の g あたり DNA の合計量を与えるソリューションでは、抽出した DNA 量に戻って関連付けることができます。細胞 1 個あたりの DNA の理論値を知ること、土壌の g ごとのセルの合計数を計算できます。

ターゲットを絞ったアプリケーション、特定の種が地域内に存在かどうかを pcr 細菌群集から抽出した DNA を受けることができます。たとえば、科学者は、土壌試料にウェルシュや炭疽など特定の病原体が含まれているかどうかを識別する必要があります。

最後に、コミュニティで現在の細菌のより包括的な理解を得るためには、DNA のサンプルはサンプル内の元の細菌のより深い分析を可能にする「弔」、バイオ情報の評価を受けることができます。"Omics"では、役割、関係、および分子生物やコミュニティの行動を探る技術の範囲について説明します。これは、遺伝子の研究とそれらの機能、または「ゲノミクス」および「プロテオミクス」タンパク質の研究とそのロールが含まれています。たとえば、サンプルからの 16S RNA の配列は特定の種の多様性のより詳細な見積もりを与えるコミュニティ内のメタゲノム定量を許可できます。このアプローチは、コミュニティの種構成の理解を深める科学者を与えることができると約束される可能性がどのような役割。

ちょうど細菌群集の DNA の抽出にゼウスの導入を見た。今、細菌群集から DNA を抽出する方法、この DNA の品質を確認する方法および細菌群集組成の調査のためのこの DNA の使用方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!

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