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纳米药物载体的生物分布:SEM的应用
 

纳米药物载体的生物分布:SEM的应用

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金属和磁性纳米粒子被广泛用作药物输送的纳米载体。其在组织中的生物分布对于评估其疗效和安全性至关重要。纳米载体是亚微米粒子,通常限制在200纳米以下,可以装载治疗剂。由于其大小,他们能够访问身体的许多部位和器官。当颗粒最终出现在体内时,称为生物分布,是评估安全性、优化给药和改善药物靶向的重要参数。

在本视频中,将介绍定向药物交付的基本原则,并演示使用高分辨率成像技术评估生物分布的方法。还将讨论纳米粒子载体的其他应用。

让我们首先讨论纳米粒子的基本原理,并理解为什么它们被开发为药物载体。

首先,纳米级颗粒(可以是聚合物、脂质体或金属)通常具有生物相容性,这意味着它们对活组织无害或反应,不会引起免疫反应。然而,为了了解材料和颗粒大小如何影响体内的生物分布,必须进行纳米毒理学研究。

其次,它们的体积小,允许它们通过炎症部位的内皮,如肿瘤的内皮外溢,并产生有效的细胞接受。随着癌细胞的分裂,需要血管供应来提供营养和氧气,并支持肿瘤生长。这些血管形成迅速,因此通常是异常和有效的,包含其内皮衬里的巨大间隙,导致血管泄漏和渗透率增加。然后,纳米粒子能够从血液中逸出,并在肿瘤微环境中积累。当纳米载体通过EPR效应或增强的渗透性和保留效应的现象到达目标器官时,这称为被动瞄准。

最后,这些纳米粒子具有较大的表面积,可以通过特定的配体(如抗体或蛋白质)发挥作用。在主动靶向中,这些配体可以识别并结合肿瘤部位细胞过度表达的受体。纳米载体表面的配体与细胞受体之间的特定相互作用触发受体介导的内分泌,并促进细胞的接受。

现在,我们已经了解了纳米粒子药物输送的基本知识,让我们来看看使用高分辨率成像来确定小鼠模型中金属纳米粒子的生物分布的演示。

首先,准备将注入小鼠的纳米粒子。这里使用了30纳米的钛和钛颗粒。小鼠被麻醉后,通过尾静脉静脉注射纳米颗粒。让鼠标在一周、四周和八周内被动地瞄准器官时恢复。

在适当的注射后时间点,根据AVMA指南对小鼠进行人道安乐死。然后打开体腔,通过手术切除感兴趣的器官,如脾脏、肾脏、肝脏和肺。并将器官储存在10%磷酸盐缓冲的形式,直到分析。

现在使用钳子将小鼠组织从固定转移到磷酸盐缓冲盐水中。每 10 分钟更换 PBS 30 分钟,以去除过量的固定剂。然后从摇床中取出组织。将含有水溶性乙二醇和树脂的最佳切削温度化合物添加到标记的塑料模具中。

用 Kimwipe 干燥组织,然后将其放入塑料模具中。用覆盖组织的OCT化合物填充模具,并放入塑料袋中。将袋子放入装有干冰的桶中,并连夜移动到零下 80 摄氏度的冰柜中。

第二天,从冷冻箱中取出样品,放在干冰上,同时运送到冷冻室。将腔室温度设置为零下 23 度,然后将样品转移到低温室。使用要分割的样品的器官类型和纳米颗粒大小标记幻灯片。然后激活冷冻器。接下来用 OCT 盖住低温夹头。然后从模具中取出样品,并将其放在夹头顶部。将夹头安装到试样支架上,并定向和调整,以便刀片将直接切割到冷冻样品上。现在,将样品靠近刀片,并将厚度设置为 30 微米,以便粗糙面对。旋转手轮以切割 30 微米厚的部分,并继续切片,直到切割均匀的组织切片。对于精细面,将截面厚度设置为 7 到 8 微米,然后切片样品。

通过按切片上标记的玻璃滑块收集部分。然后将滑轨添加到机架中,并在室温下晾干。干燥后,将滑轨架中 50% 乙醇再浸下三分钟,取出 OCT.将机架转移到 80% 乙醇,然后浸入 3 分钟。然后,将机架移至冷甲醇与丙酮的一比一,并在零下 20 摄氏度的冰箱中放置。10 分钟后,从冰箱中取出滑架,并将其排干纸巾上。干燥时,将幻灯片放在滑动盒中,并储存在零下 20 摄氏度,直到使用。

现在,让我们来想象一下在注射一周后收集的小鼠肺组织,这些颗粒含有30纳米的钚和钛颗粒,以确定其生物分布。首先,将准备好的幻灯片安装到 SEM 舞台上。要了解如何溅射涂层和准备样品,请观看此系列中的上一段视频。然后将舞台加载到 SEM 室中。样品进入视野后,垂直移动样品至约 5 毫米的工作距离。打开电子束,然后选择二次电子的探测器。然后将光束加速电压设置为 25 千电子伏。要开始成像,放大样本的放大倍数约为 1,000 到 2,000 倍。在这种放大倍率下,即使纳米粒子不是可见的,也应当可以看到包含纳米粒子的结构。这称为次映像。

现在,在 SEM 模块中接合反向散射电子检测模式,以可视化纳米粒子。沿 Z 方向移动舞台,以达到上述相同的五毫米工作距离。调整反向散射检测器的配置,对检测面板使用不同的电压偏置,直到图像清晰。高对比度区域,即纳米粒子,现在应该是可见的。这是背面散落的图像。捕获并保存图像。

接下来,获得能量分散X射线光谱或EDS数据的样品。放大纳米粒子团的高对比度区域。然后打开造型室中的第二个摄像头,然后将 EDS 降至系统中。观看相机屏幕以确保 EDS 接近,但不会触摸 BSD 或电子枪。然后打开微分析软件并获取图像。使用鼠标选择感兴趣的区域以进行进一步分析。然后显示该区域的 X 射线光谱。在这里,峰代表钛和钛,确认样品中存在金属纳米粒子。现在打开定性数据分析软件,并映射幻灯片上器官的边界。然后从菜单中选择并运行相应的协议,以创建器官的马赛克图像。这可能需要几个小时。

完成后,将其导出为 TIF 文件,并在 ImageJ 中打开该文件。调整对比度阈值以突出显示极高对比度区域,即纳米粒子。然后选择"分析粒子",以获得器官中纳米粒子的平均数量和包含纳米粒子的器官的面积百分比。

对其他时间点和器官的剩余组织样本重复此步骤。收集所有数据后,将其编译为生物分布图。

现在,让我们分析图像以确定生物分布,并了解人体如何处理纳米粒子。首先绘制所测粒子分布作为所有分析样本的时间函数。这是30纳米大小的纳米粒子在不同小鼠器官中随时间的分布。八周后纳米粒子总体减少,表明纳米粒子从体内清除。

然而,四周后肝脏中的纳米粒子浓度增加。这表明,人体可能正在处理在这项研究中用作毒素的30纳米钛纳米粒子。也可以进行这种分析,以评估纳米粒子的大小如何影响其在体内的生物分布。改变纳米粒子的大小会影响整体细胞的接受率和间隙率。

纳米粒子和纳米载体广泛用于生物医学研究,并具有成像、诊断和治疗剂等应用。纳米粒子正在开发用于疫苗输送,以预防各种传染病,因为它们保护疫苗成分免受降解,并最大限度地增强免疫刺激。正在开发跨层交联多片囊泡(ICMV),用于诱导抗原特异性CD8阳性T细胞反应。

这些ICMV专门在小鼠淋巴结中进行局部化,以有效提供疫苗,并引起对疟疾抗原和肿瘤细胞的强效免疫反应。金属纳米粒子常用作磁共振成像中的造影剂,用于可视化组织结构和早期疾病检测功能。氧化铁纳米颗粒是有用的诊断探头。当用双磷酸盐莫伊蒂合成时,这些纳米粒子快速、有选择地积累在动脉粥样硬化斑块中,并在一小时内实现可视化,以便快速诊断。

最近,加载的纳米载体被开发为一种策略,以同时检测早期癌症和提供化疗剂。这些纳米载体被称为神经病,因为它们集成了诊断和治疗能力。

您刚刚观看了 JoVE 关于确定纳米药物载体生物分布的视频。现在,您应该了解纳米药物载体的基本原理,如何使用高分辨率 SEM 检测组织样本中的纳米载体,确定其生物分布,以及纳米粒子在生物医学工程中的一些应用。

谢谢你的收看。

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