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ナノドラッグキャリアのバイオディストリビューション
 

ナノドラッグキャリアのバイオディストリビューション:SEMの応用

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Click here for the English version.

金属・磁性ナノ粒子は、薬物送達のナノキャリアとして広く使用されています。そして、組織におけるそれらの生体分布は、その治療効果と安全性を評価するために不可欠です.ナノキャリアは、サブミクロン粒子であり、通常は200ナノメートル未満に制限され、治療薬を装填することができる。そのサイズのために、彼らは体内の多くのサイトや臓器にアクセスすることができます。粒子が体内で終わる場所は、その生体分布と呼ばれ、安全性を評価し、薬物の標的化を最適化し、改善するために使用される重要なパラメータです。

本ビデオでは、標的薬物送達の基本原理について説明し、高解像度イメージング技術を用いて生体分布を評価する方法を実証する。ナノ粒子ベースのキャリアの他の用途についても議論する。

まず、ナノ粒子の基礎について話し合い、なぜ薬剤キャリアとして開発されているのかを理解しましょう。

第一に、ポリマー、リポソーム、または金属のいずれかであり得るナノスケールの粒子は、通常生体適合性であり、生体組織に有害または反応性がなく、免疫応答を引き起こさないことを意味する。しかし、ナノ毒性学の研究は、材料と粒度が体内の生物分布にどのように影響するかを理解するために行われなければなりません。

第二に、その小さなサイズは、腫瘍のような炎症部位の内皮を通して彼らの贅沢を可能にし、効率的な細胞取り込みをもたらす。がん細胞が分裂するにつれて、栄養素と酸素を供給し、腫瘍の増殖を支えるために血管供給が必要です。これらの血管は急速に形成され、したがって通常異常かつ効果的であり、内皮内層に大きな隙間を含み、漏れやすい血管系と透過性の増加をもたらす。ナノ粒子は、血流から脱出し、腫瘍の微小環境内に蓄積することができます。これは、ナノキャリアがEPR効果または強化された透過性と保持の影響として知られている現象を介してターゲット臓器に到達するパッシブターゲティングと呼ばれます。

最後に、これらのナノ粒子は、抗体やタンパク質などの特定のリガンドで機能化することができる大きな表面積を有する。活性ターゲティングにおいて、これらのリガンドは、腫瘍部位の細胞によって過剰発現される受容体を認識し、結合することができる。ナノキャリア表面上のリガンドと細胞受容体との間の特異的相互作用は、受容体媒介性エンドサイトーシスを引き起こし、細胞の取り込みを促進する。

ナノ粒子薬物送達の基本を理解した今、マウスモデルにおける金属ナノ粒子の生体分布を決定するために高解像度イメージングを用いたデモンストレーションを見てみましょう。

まず、マウスに注入されるナノ粒子を調製する。ここでは30ナノメートルのバリウムとチタン粒子を用いた。マウスが麻酔された後、尾静脈を介して静脈内にナノ粒子を注入する。1週間、4週間、8週間にわたって臓器を受動的に標的にしている間、マウスを回復させます。

適切な注入時時点で、AVMAガイドラインに従ってマウスを人道的に安楽死させる。その後、体腔を開き、脾臓、腎臓、肝臓、肺などの目的の器官を外科的に取り除きます。そして、分析するまで10%リン酸緩衝ホルマリンに臓器を保存します。

今、鉗子を使用して、固定剤からリン酸緩衝生理食塩分にマウス組織を移します。サンプルを10分ごとにPBSに交換して30分間ロックし、余分な固定剤を除去します。その後、シェーカーから組織を取り除きます。水溶性グリコールと樹脂を含む最適な切断温度化合物を標識プラスチック金型に追加します。

キムワイプでティッシュを乾かし、プラスチック型に入れます。組織を覆うOCT化合物で金型を充填し、ビニール袋に入れます。ドライアイス入ったバケツに袋をセットし、一晩マイナス80度の冷凍庫に移動します。

翌日、冷凍庫からサンプルを取り出し、クライオスタットに運ぶ間ドライアイスの上に置きます。チャンバー温度をマイナス23度に設定し、サンプルをクライオスタットに移します。セクションするサンプルの臓器タイプとナノ粒子サイズでスライドにラベルを付けます。その後、クライオスタットを活性化します。次に、OCTでクライオスタットチャックをカバーします。次に、金型からサンプルを取り出し、チャックの上に置きます。チャックを試料ホルダーに取り付け、回転を調整して、ブレードが凍ったサンプルをまっすぐ横切るように調整します。次に、サンプルをブレードに近づけ、厚さを粗い向きの 30 マイクロメートルに設定します。ハンドホイールを回転させて30マイクロメートルの厚さのセクションをスライスし、偶数のティッシュスライスがカットされるまで断面を続けます。細かい面の場合は、断面の厚さを7~8マイクロメートルに設定し、サンプルをスライスします。

スライス上のラベル付きガラススライドを押してセクションを収集します。次に、スライドをラックに追加し、室温で空気乾燥させます。乾かしたら、スライドラックを50%エタノールで3分間繰り返し浸してOCTを取り外し、ラックを80%エタノールに移し、3分間浸します。次に、ラックをアセトンに対する冷たいメタノールの1対1の比率に移動し、マイナス20°Cの冷凍庫に置きます。10分後、スライドラックを冷凍庫から取り出し、ペーパータオルで水切りします。乾いたらスライドをスライドボックスに入れ、使用するまでマイナス20°Cで保存します。

それでは、30ナノメートルのバリウムとチタン粒子を用いて1週間のポストインジェクションを採取したマウス肺組織を画像化し、その生体分布を決定してみましょう。まず、準備したスライドをSEMステージにマウントします。スパッタコートとサンプルを準備する方法については、このコレクションの前のビデオをご覧ください。その後、SEMチャンバーにステージをロードします。サンプルが視野に入ったら、サンプルを約 5 ミリメートルの作業距離に垂直に移動します。電子ビームをオンにし、二次電子の検出器を選択します。次に、ビーム加速電圧を25キロ電子ボルトに設定します。イメージングを開始するには、サンプルを約 1,000 ~ 2,000X の倍率に拡大します。この倍率では、ナノ粒子がそうでない場合でも、ナノ粒子を含む構造が見えるはずです。これをセカンダリ・イメージと呼ばれます。

次に、SEMモジュールで後方散乱電子検出モードを使用して、ナノ粒子を可視化します。ステージを Z 方向に移動して、上記と同じ 5 ミリメートルの作業距離を実現します。バックスキャッタ検出器の構成を調整し、画像が鮮明になるまで検出パネルに異なる電圧バイアスを使用します。高コントラストの領域、ナノ粒子が、今すぐ見えるはずです。これは後方散乱画像です。イメージをキャプチャして保存します。

次に、試料のエネルギー分散型X線分光法またはEDSデータを達成する。ナノ粒子の塊の高コントラスト領域を拡大します。次に、チャンバー内の 2 番目のカメラを開き、EDS をシステムに下げます。カメラの画面を見て、EDS が近づくことを確認しますが、BSD や電子銃には触れません。次に、マイクロ分析ソフトウェアを開き、画像を取得します。マウスを使用して、詳細な分析のために関心のある領域を選択します。その領域の X 線スペクトルが表示されます。ここでピークは、試料中の金属ナノ粒子の存在を確認するバリウム及びチタンを表す。今、定性的なデータ分析ソフトウェアを開き、スライド上の臓器の境界線をマップします。次に、メニューから適切なプロトコルを選択して実行し、オルガンのモザイク画像を作成します。この場合、数時間かかる場合があります。

完了したら、TIF ファイルとしてエクスポートし、ImageJ でファイルを開きます。コントラストしきい値を調整して、非常に高いコントラストの領域であるナノパーティクルをハイライトします。次に、[パーティクルの分析] を選択して、臓器内のナノ粒子の平均数とナノ粒子を含む臓器の面積パーセンテージを取得します。

他の時点および器官からの残りの組織サンプルについて、この手順のすべてのステップを繰り返します。すべてのデータが収集されたら、それを生体分布グラフにコンパイルします。

次に、画像を分析して生物分布を決定し、体がナノ粒子をどのように処理したかを学びましょう。まず、分析されたすべてのサンプルの時間関数として測定された粒子分布をプロットします。これは、時間の経過に従って様々なマウス器官における30ナノメートルサイズのナノ粒子の分布です。8週間後のナノ粒子の全体的な減少は、体内からのナノ粒子のクリアランスを示す。

しかし、4週間後に肝臓にナノ粒子濃度が上昇する。これは、体が毒素としてこの研究で使用される30ナノメートルのバリウムとチタンナノ粒子を処理している可能性があることを示唆しています。この分析は、ナノ粒子の大きさが体内の生体分布にどのような影響を与えるかを評価するためにも行うことができる。ナノ粒子のサイズを変更すると、全体的な細胞の取り込み速度とクリアランス率に影響を与えました。

ナノ粒子やナノキャリアは、生物医学研究で広く使用されており、イメージング、診断、治療薬としての応用があります。ナノ粒子は、ワクチン成分を劣化から守り、免疫刺激を最大化するため、多種多様な感染症に対するワクチン送達に用いるために開発されています。二層間架橋多層小胞、またはICmVは、抗原特異的CD8陽性T細胞応答の誘導のために開発されている。

これらのICMVは、効率的なワクチン送達のためにマウスのリンパ節に特異的に局在し、マラリア抗原および腫瘍細胞に対する堅牢な免疫応答を引き起こしている。金属ナノ粒子は、磁気共鳴画像の造影剤として多く用いられ、組織の構造を可視化し、早期疾患検出に機能します。酸化鉄ナノ粒子は有用な診断プローブである。ビスホスホネート部分で合成すると、これらのナノ粒子はアテローム硬化性プラークに迅速かつ選択的に蓄積し、迅速な診断のために1時間以内にその可視化を可能にする。

近年、積載ナノキャリアは、早期癌を同時に検出し、化学療法剤を送出する戦略として開発されている。これらのナノキャリアは、診断能力と治療能力を統合するため、トラノスティックスと呼ばれています。

あなたはちょうどナノドラッグキャリアの生体分布を決定するJoVEのビデオを見ました。ナノドラッグキャリアの基本原理、高解像度SEMを用いて組織サンプル中のナノキャリアを検出する方法、その生体分布を決定する方法、および生物医学工学におけるナノ粒子のいくつかの応用を知る必要があります。

見てくれてありがとう。

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